【摘要】：替普瑞酮(Teprenone或Geranylgeranylacetone)作為一類安全、高效的胃腸黏膜保護(hù)劑,在人類和畜禽中已有相關(guān)研究報(bào)道,但其在水產(chǎn)動(dòng)物中的研究還較少。本研究以中國(guó)南方重要的經(jīng)濟(jì)魚類品種花鱸(Lateolabrax maculatus)為研究對(duì)象,經(jīng)預(yù)投喂替普瑞酮,研究其對(duì)花鱸腸道缺氧應(yīng)激的損傷防護(hù)作用,進(jìn)一步結(jié)合花鱸腸道組織形態(tài)、腸道菌群組成、氧化應(yīng)激相關(guān)因子、非特異性免疫、細(xì)胞凋亡相關(guān)因子活性及其相關(guān)基因表達(dá)情況分析,以探究替普瑞酮對(duì)花鱸腸道缺氧應(yīng)激的保護(hù)作用機(jī)理。具體研究結(jié)果如下:1.研究了替普瑞酮對(duì)周期性缺氧應(yīng)激花鱸腸道組織形態(tài)的影響。研究發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期周期性缺氧應(yīng)激引起花鱸腸道絨毛長(zhǎng)度降低,腸上皮細(xì)胞脫落,替普瑞酮處理組(HT200,HT400和HT800組,以下稱HT組)腸道絨毛長(zhǎng)度、絨毛寬度和肌肉層厚度之間無(wú)顯著差異(P0.05),且與常氧對(duì)照組(NC組)差異不顯著(P0.05)。與缺氧對(duì)照組(HC組)相比,HT組腸道組織結(jié)構(gòu)較為完整,無(wú)明顯上皮細(xì)胞脫落情況。結(jié)果表明,預(yù)先拌喂不同濃度替普瑞酮能維護(hù)周期性缺氧應(yīng)激花鱸腸道組織結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)。2.基于Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù),分析了替普瑞酮對(duì)周期性缺氧應(yīng)激花鱸腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。研究發(fā)現(xiàn),周期性缺氧導(dǎo)致花鱸腸道菌群多樣性和豐富度顯著增加,群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜化。缺氧對(duì)照組(HC組)腸道菌群分類操作單元(operational taxonomic units,OTUs)顯著增高,其特有OTUs數(shù)達(dá)334個(gè),與其他組存在較大差異。在門的分類水平上,變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為各組腸道菌群主要組成菌門。與NC組相比,HC組變形菌門相對(duì)豐度顯著降低(P0.05),擬桿菌門的相對(duì)豐度顯著升高(P0.05),HT組花鱸腸道菌門組成與NC組無(wú)顯著差異(P0.05)。在綱水平上,HC組α變形菌綱(Alphaproteobacteria)、芽孢桿菌綱(Bacilli)相對(duì)豐度顯著降低(P0.05),梭菌綱(Clostridia)、γ變形菌綱(Gammaproteobacteria)和擬桿菌綱(Bacteroidia)相對(duì)豐度顯著升高(P0.05)。HT400組α變形菌綱相對(duì)豐度介于NC組和HC組之間,梭菌綱、γ變形菌綱和芽孢桿菌綱相對(duì)豐度與NC組差異不顯著(P0.05)。此外,周期性缺氧應(yīng)激還引起花鱸腸道內(nèi)厭氧繩菌科(Anaerolineaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)等厭氧或兼性厭氧菌和綠硫菌科(Chlorobiaceae)等光合產(chǎn)氧菌類相對(duì)豐度升高。結(jié)果表明,缺氧導(dǎo)致花鱸腸道菌群群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜化,有益菌種(如α變形菌綱)相對(duì)豐度降低,條件致病菌(如擬桿菌綱)相對(duì)豐度升高,400mg/kg替普瑞酮投喂對(duì)于維護(hù)周期性缺氧應(yīng)激花鱸腸道組織菌群穩(wěn)態(tài)具有良好作用。3.通過(guò)免疫相關(guān)酶活與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和基因表達(dá)情況分析,探究替普瑞酮對(duì)花鱸腸道周期性缺氧應(yīng)激的損傷防護(hù)作用機(jī)理。(1)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)分析發(fā)現(xiàn),HC組超氧化物歧化酶(SOD),過(guò)氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量顯著升高(P0.05),總抗氧化能力(T-AOC)顯著低于NC組(P0.05)。HT200和HT400組抗氧化酶活性和MDA含量介于HC和NC組之間。(2)非特異性免疫相關(guān)指標(biāo)分析發(fā)現(xiàn),HC組溶菌酶(LZM)活性最低,且與NC組差異顯著(P0.05)。HT200組LZM活性顯著高于HC組(P0.05)。熱休克蛋白70(HSP70)含量及基因相對(duì)表達(dá)量在NC組、HT200和HT400組較高,在HC組和HT800組較低。HC組HSP90 mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著低于其他組(P0.05),HT200和HT400組HSP90基因相對(duì)表達(dá)水平略低于NC組,兩組之間無(wú)顯著性差異(P0.05)。(3)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子活性及其基因表達(dá)情況分析發(fā)現(xiàn),HC組細(xì)胞色素C(Cyt-C)含量,caspase3活性和caspase9 mRNA表達(dá)水平顯著高于NC組(P0.05),Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著低于NC組(P0.05)。HT組caspase9活性和基因表達(dá)水平接近于NC組。HT400組caspase3活性最低,與NC組差異不顯著(P0.05)。HT組Bcl-2 mRNA表達(dá)水平與NC組差異不顯著(P0.05)。結(jié)果表明,周期性低氧可以引起腸道組織的氧化應(yīng)激,降低其非特異性免疫水平,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。替普瑞酮可在一定程度保護(hù)腸道組織,降低其氧化應(yīng)激損傷,增強(qiáng)非特異性免疫酶活性及相關(guān)蛋白表達(dá),抑制細(xì)胞凋亡因子活性及基因表達(dá)。4.在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究了替普瑞酮對(duì)花鱸腸道急性缺氧應(yīng)激的損傷防護(hù)作用機(jī)理。(1)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)分析發(fā)現(xiàn),缺氧對(duì)照組(以下稱Control組)SOD活性在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與400mg/kg替普瑞酮處理組(以下稱Teprenone組)差異不顯著(P0.05);CAT活性在0h顯著高于Teprenone組(P0.05);T-AOC在6,12,24和48h時(shí)間點(diǎn)均顯著高于Teprenone組(P0.05);MDA含量在B和12h時(shí)間點(diǎn)顯著高于Teprenone組(P0.05)。(2)非特異性免疫相關(guān)指標(biāo)分析發(fā)現(xiàn),除12h時(shí)間點(diǎn)外,Control組LZM活性均低于Teprenone組,其中6和48h兩組差異顯著(P0.05)。與B時(shí)間點(diǎn)相比,0h時(shí)Control組HSP70含量有較大幅度升高。在0-48h,Control組HSP70含量呈逐漸降低趨勢(shì),且均高于Teprenone組。(3)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子活性分析發(fā)現(xiàn),Cyt-C,caspase9和caspase3活性在兩組均呈先升高后降低的趨勢(shì)。Control組Cyt-C含量在3h和48h顯著高于Teprenone組(P0.05),caspase9和caspase3活性在B-48h均高于Teprenone組。結(jié)果表明,急性缺氧應(yīng)激導(dǎo)致花鱸腸道氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡相關(guān)因子表達(dá)水平在0-12h內(nèi)呈逐漸升高的趨勢(shì),在12-48h內(nèi)逐漸降低;非特異性免疫水平在0-48h呈先降低后升高的趨勢(shì);400mg/kg替普瑞酮預(yù)投喂可在一定程度保護(hù)腸道組織,在急性缺氧后0-48h內(nèi),可有效防護(hù)腸道氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)非特異性免疫能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,缺氧對(duì)花鱸腸道組織產(chǎn)生應(yīng)激損傷,影響腸組織形態(tài)與腸道菌群結(jié)構(gòu),替普瑞酮對(duì)其應(yīng)激損傷具有一定保護(hù)作用。其中,拌喂400mg/kg替普瑞酮對(duì)花鱸腸組織形態(tài)及菌群穩(wěn)態(tài)的維持具有較好的效果,可降低周期性及急性缺氧應(yīng)激所引起的氧化損傷,增強(qiáng)非特異性免疫酶活性及相關(guān)蛋白表達(dá),抑制細(xì)胞凋亡因子活性及基因表達(dá),從而起到腸道應(yīng)激損傷防護(hù)功能。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S948
【圖文】：

圖 1 中腸組織結(jié)構(gòu)觀察（H.E 染色）[13]Fig.1 Midgut histology（H.E staining）10：中腸橫切；11：中腸腸絨毛橫切；12：中腸肌層橫切GC：杯狀細(xì)胞（Goblet cell）；SEC：?jiǎn)螌又鶢钌掀ぃ⊿imple epithelium columnar）；BB：紋狀緣（Brush border）；LP：固有膜（Lamina propria）；S：漿膜（Serosa）；CSM：環(huán)�。–ircularmuscle）；LSM：縱�。↙ongitudinal muscle）；SM：黏膜下層（Submucosa）3.2 魚類腸道菌群與功能動(dòng)物腸道內(nèi)寄生著大量微生物，該“微生物組(microbiome)”如同宿主的額外“器官”，行使著宿主自身沒(méi)有的一些重要功能。在魚類生長(zhǎng)發(fā)育初始階段，水體微生物可能為腸道優(yōu)勢(shì)菌的重要來(lái)源[22-23]。魚類腸道菌群是一個(gè)由好氧菌、兼性厭氧菌和厭氧菌共同組成的動(dòng)態(tài)菌群。這種特殊動(dòng)態(tài)菌群環(huán)境，被稱作腸道“島嶼”微生物群落。腸道微生態(tài)平衡是魚體腸道健康的保證，而微生態(tài)的平衡需要多種腸道有益菌的維持[24]。正常情況下，魚類腸道的各種微生物生長(zhǎng)良好，占主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)的有益微生物菌群如變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門等菌群[25]一方面提供外源性消

HT400 和 HT800 組水體溶氧水平每天分為持為 6.0±0.2 mg·L-1；階段 2：0:00-0:30，DO g·L-1；階段 3：0:30-2:30，DO 維持在 2.5±0.2.5±0.2 mg·L-1逐漸恢復(fù)至 6.0±0.2 mg·L-1。周期組實(shí)驗(yàn)魚除溶氧及投喂飼料外，其他日常管理市售鱸魚專用配合飼料。實(shí)驗(yàn)飼料為將基礎(chǔ)、800 mg/kg 比例添加替普瑞酮（衛(wèi)材（中國(guó)）陰干，備用。的檢測(cè)和調(diào)整，采用吳鑫杰[117]的方法并稍加其基本原理是以實(shí)時(shí)監(jiān)控裝置檢測(cè)水體溶氧，水平，并通過(guò)控制氣體充入速率精確溶氧控促進(jìn)水體流動(dòng)，保證養(yǎng)殖桶中各個(gè)部分水體

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文HC 組完整，腸壁由內(nèi)向外分層清晰，腸上皮細(xì)胞緊密連接，未見(jiàn)到明顯的上皮胞脫落；腸絨毛形態(tài)完整、致密；杯狀細(xì)胞分布致密，排列整齊。HT200, HT4和 HT800 組（以下并稱 HT 組）腸上皮細(xì)胞脫落的情況明顯較 HC 組減少，腸毛排列較為整齊。比較各處理組絨毛長(zhǎng)度、絨毛寬度和肌肉層厚度發(fā)現(xiàn)，各組毛長(zhǎng)度具有一定差異性，HC 組絨毛長(zhǎng)度顯著低于 NC 組和 HT 組（P＜0.05），H組與 NC 組無(wú)顯著差異（P＞0.05），HT 組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）（圖 2-3）。

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本文編號(hào)：2779483