【摘要】：脊椎動(dòng)物的性別決定類型可分為遺傳性別決定(GSD)、環(huán)境性別決定(ESD)、遺傳與環(huán)境性別決定(GSD+ESD)三大類。在各種環(huán)境因素中,溫度對(duì)性別決定的影響因素最大所以稱為溫度性別決定(TSD)。有些魚類的性別決定受遺傳和溫度的雙重調(diào)控,被稱為遺傳性別決定和溫度性別決定的混合型(GSD+TSD),如尼羅羅非魚就是一種GSD+TSD魚類。前人已發(fā)現(xiàn)高溫能影響性腺中許多雌性性別分化相關(guān)基因如Cyp19a1a和雄性性別分化相關(guān)基因如Dmrt1等的表達(dá),然而,很少有研究在熱敏期(TSP)期間進(jìn)行溫度處理對(duì)腦中的相關(guān)基因表達(dá)的影響。因此,本試驗(yàn)中首次利用尼羅羅非魚腦組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序來揭示在性別分化關(guān)鍵期尼羅羅非魚高溫性逆轉(zhuǎn)過程中腦中的基因表達(dá)變化。本研究建立了三個(gè)全雌家系(F1-F3),三個(gè)全雌家系高溫處理后的雄性率分別為65%(F1)、74%(F2)和87%(F3)。從上述3個(gè)家系中挑選高溫處理后雄性率最高的F3家系,在21 dpf時(shí),取F3家系中對(duì)照雌魚組(FC)和高溫處理組(FT)的腦組織用于轉(zhuǎn)錄組分析。同時(shí)建立了1個(gè)正常家系,在21dpf時(shí),采用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定幼魚的雌雄,選取雄性個(gè)體的腦組織作為對(duì)照雄魚組(MC)用于轉(zhuǎn)錄組分析。高通量分析結(jié)果顯示FC、FT和MC三組共獲得351,146,876個(gè)clean reads。三組之間兩兩比較,結(jié)果顯示:在FC/FT、FC/MC和MC/FT比較組中分別獲得的差異表達(dá)基因(DEG)數(shù)目為:105、3164和4666個(gè),其中FC/FT組中上調(diào)的DEG有87個(gè),下調(diào)的DEG有18個(gè);FC/MC組中上調(diào)的DEG有1123個(gè),下調(diào)的DEG有2041個(gè);MC/FT組中上調(diào)的DEG有3354個(gè),下調(diào)的DEG有1312個(gè)。Venn圖顯示FC/FT和FC/MC、FC/FT和MC/FT、FC/MC和MC/FT重疊的DEG數(shù)目分別為31、88和2534個(gè)。此外,本試驗(yàn)通過GO、KEGG和趨勢(shì)分析對(duì)各比較組的DEG進(jìn)行進(jìn)一步分析與篩選。其中GO分析表明DEG主要涉及參與了單生物過程(Single-organism Process)、代謝過程(Metabolic Process)、細(xì)胞過程(Cellular Process)和結(jié)合(Binding)等生物學(xué)功能。大多數(shù)的DEG主要富集在細(xì)胞粘附因子(Cell adhesion molecules)、代謝通路(Metabolic pathways)、抗生素的生物合成(Biosynthesis of antibiotics)等生物學(xué)通路中。通過趨勢(shì)分析共篩選出16個(gè)DEG,其mRNA表達(dá)水平在高溫處理后表現(xiàn)出顯著的下調(diào)或上調(diào),并達(dá)到與MC相似的水平。在這16個(gè)DEG中,LOC100699848(lysine specific demethylase 6A)和Jarid2都含有JmjC結(jié)構(gòu)域,表明JmjC結(jié)構(gòu)域可能在尼羅羅非魚進(jìn)行溫度處理的過程中起著重要的作用。最后,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)對(duì)9個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證。本研究結(jié)果將為研究魚類GSD+TSD的分子機(jī)制提供重要的線索。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S917.4
【圖文】：

圖 1 RNA-seq 的試驗(yàn)設(shè)計(jì)Fig. 1 Experimental design of RNA-seq in this study.遺傳上全雌家系的受精卵在 28℃下培養(yǎng)，當(dāng)孵出的幼魚可以自由游動(dòng)時(shí)(約 9 天后),將受精卵一分為C 組，受精卵和幼魚總是在 28℃下培養(yǎng)。對(duì)于 FT 組，將可以自由游動(dòng)（熱敏期，TSP）的幼魚施加36℃高溫處理并持續(xù) 12 天。在 TSP 末端（21dpf）對(duì) FC 和 FT 組進(jìn)行了全腦取樣。fter the fertilized eggs from a genetically all-female family were cultivated at 28 °C for about 9 days, thearvae can swim freely. For FC group, the fertilized eggs and larvae were always cultured at 28 °C. For FT 36 °C high temperature treatment was applied from just freely swimming larvae and lasted for 12 daysensitive Period, TSP). Before the high temperature treatment, the fertilized eggs and larvae were reared at28 °C. We collected isolated whole brain samples at the end of TSP from FC and FT group.儀器與試劑機(jī)：美國(guó) Minitowac S-150；機(jī)：德國(guó) Sigma 公司；離心機(jī)：德國(guó) Sigma 公司；熒光定量 PCR 儀：美國(guó) ABI 7500 PCR 儀；

Oligo（dT）的磁珠富集 mRNA，向得到的 mRNA 中加入 fragmentati為短片段，再以片斷化的mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物（random h 第一鏈，并加入緩沖液、dNTPs、RNase H 和 DNA polymerase I 合成過 QiaQuick PCR 試劑盒純化并加 EB 緩沖液洗脫經(jīng)末端修復(fù)、加堿再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段，并進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，從而完作，構(gòu)建好的文庫用 Illumina HiSeqTM進(jìn)行測(cè)序。Seq 生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾后，得到 clean data，將其比對(duì)到選定的尼羅羅非魚參考 Cufflinks 對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行組裝，共產(chǎn)生兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本：已知的轉(zhuǎn)錄本和新已知轉(zhuǎn)錄本中所包含的的基因進(jìn)行表達(dá)量分析與統(tǒng)計(jì)，并進(jìn)行差異表分析。另外，通過基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化、可變剪切等對(duì)基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士專業(yè)學(xué)位論文 雌性對(duì)照組（28℃）；B：XY 雄性對(duì)照組（28℃）；C：高溫處理組未發(fā)生性逆轉(zhuǎn)的 XX 雌性（36℃理組發(fā)生性逆轉(zhuǎn)的 XX 偽雄魚（36℃）；PVO：卵黃發(fā)生前期的卵母細(xì)胞；SG：精原細(xì)胞；SP：精母SZ：精子。Fig. 3 The histological analysis of gonad.X females in control group reared at 28 °C; B: XY males reared at 28 °C; C: XX females in high temperaturegroup reared at 36 °C; D: XX neomales in high temperature treated group reared at 36 °C; PVO = oocytes at tpre-vitellogenic stage; SG = spermatogonium; SP = spermatocyte; SZ = spermatozoa;通過組織學(xué)檢測(cè)，經(jīng)過高溫處理后三個(gè)全雌家系的雄性比例分別為（圖 4）：）、74％（F2）、87％（F3）。然而，經(jīng)過高溫處理后，仍有一小部分個(gè)體沒為雄性。為了消除 FT 組中未發(fā)生性逆轉(zhuǎn)的個(gè)體所帶來的誤差，選用高溫處理最高的全雌家系（F3）兩組魚作為 FC 和 FT 組用于轉(zhuǎn)錄組分析，每組設(shè)置三重復(fù)，每個(gè)重復(fù)包含 10 尾魚的腦組織。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 尚曉莉;曲憲成;;魚類性別決定和性別分化機(jī)制研究進(jìn)展[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué);2010年04期

2 孫麗葉;陳彪;;基因決定腦的性別分化[J];中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志;2009年03期

本文編號(hào)：2779198