發(fā)布時(shí)間：2020-07-30 05:08

【摘要】：擬穴青蟹(Scylla paramamosain)是中國(guó)東南沿海重要的海水養(yǎng)殖蟹類,養(yǎng)殖過程中持續(xù)遭受病原微生物的感染�？咕�(Antimicrobial peptide)是青蟹先天免疫系統(tǒng)中的重要效應(yīng)分子,其具有的廣譜抗菌活性、不易產(chǎn)生耐藥性等特性使其成為傳統(tǒng)抗生素的替代者之一。Crustins是目前蟹類中研究比較廣泛的一類抗菌肽,為揭示青蟹抗菌肽Crustin的功能,本論文選取SpCrus5(GenBank登錄號(hào)MF431586)和SpCrus6(GenBank登錄號(hào)MF431585),利用體外重組表達(dá)或肽段合成方式,確定抗菌譜和抗菌活性,揭示其殺菌機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:(1)聯(lián)合多肽Scy-SpCrus5的真核重組表達(dá)及抗菌活性:構(gòu)建pPIC9K-Scy-SpCrus5真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入畢赤酵母(Pichia Pastoris)GS115進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),結(jié)果顯示,甲醇誘導(dǎo)濃度0.5%,28oC下培養(yǎng)24 h時(shí)表達(dá)聯(lián)合多肽Scy-SpCrus5。大量表達(dá)后采用鎳柱親和層析純化,將獲得的目的抗菌肽進(jìn)行體外抗菌活性研究。結(jié)果表明,15μM下重組表達(dá)的聯(lián)合多肽,對(duì)所選的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌無明顯的殺菌作用。(2)Scy-SpCrus5對(duì)金黃色葡萄球菌的作用機(jī)制:聯(lián)合多肽Scy-SpCrus5與金黃色葡萄球菌共孵45 min,共聚焦激光掃描顯微鏡(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)觀察抗菌肽與微生物互作后的定位情況,結(jié)果顯示,聯(lián)合多肽Scy-SpCrus5可作用于金黃色葡萄球菌細(xì)胞表面,而Scygonadin處理下(對(duì)照組)無該現(xiàn)象;進(jìn)一步酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)實(shí)驗(yàn)研究Scy-SpCrus5與金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁組分的結(jié)合情況,結(jié)果顯示,在濃度0.5μM時(shí),聯(lián)合多肽Scy-SpCrus5即可結(jié)合脂磷壁酸(Lipoteichoic acid,LTA),且結(jié)合效率與蛋白濃度呈正相關(guān)。(3)SpCrus6_(29-47)抗菌活性及殺菌動(dòng)力學(xué)曲線:生物信息學(xué)分析并預(yù)測(cè)SpCrus6_(29-47)具有抗菌活性,體外合成肽段SpCrus6_(29-47)進(jìn)行抗菌活性實(shí)驗(yàn),革蘭氏陽性菌中,對(duì)谷氨酸棒狀桿菌、藤黃微球菌、溶壁微球菌、金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的殺菌作用,最小抑制濃度(Minimal inhibitory concentration:MIC)為6~24μM;革蘭氏陰性菌中,對(duì)熒光假單胞菌、施氏假單胞菌抑殺作用較弱,MIC為24~48μM,對(duì)大腸桿菌模式株、弗氏志賀氏菌無抗菌活性,MIC為48μM,結(jié)果表明,SpCrus6_(29-47)對(duì)革蘭氏陽性菌有更強(qiáng)抗菌活性。殺菌動(dòng)力學(xué)曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)SpCrus6_(29-47)與金黃色葡萄球菌共孵5 min時(shí),殺菌指數(shù)為50%,共孵2 h后,殺菌指數(shù)達(dá)到100%。(4)初步揭示SpCrus6_(29-47)對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌機(jī)制:當(dāng)合成肽SpCrus6_(29-47)與金黃色葡萄球菌共孵45 min時(shí),掃描電子顯微鏡(Scanning electron microscope,SEM)觀察到細(xì)菌細(xì)胞表面粗糙,表面結(jié)構(gòu)崎嶇不平,出現(xiàn)大量細(xì)胞碎片,而對(duì)照組細(xì)菌細(xì)胞光滑、完整、細(xì)胞形態(tài)未改變。透射電子顯微鏡(Transmission electron microscope,TEM)觀察到細(xì)胞質(zhì)膜破裂,甚至完全消失,細(xì)菌周圍出現(xiàn)碎片,而對(duì)照組細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜完整,膜結(jié)構(gòu)清晰可見且連續(xù)。流式細(xì)胞儀分析SYTO 9/PI的攝入情況,結(jié)果顯示,SpCrus6_(29-47)處理后的金黃色葡萄球菌對(duì)熒光染料PI的攝入量明顯增多,揭示SpCrus6_(29-47)可以改變金黃色葡萄球菌細(xì)胞質(zhì)膜的通透性。
【學(xué)位授予單位】：集美大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S945

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