【摘要】：海洋微生物多樣性高,分布廣泛,既是初級生產(chǎn)者又是分解者,與浮游植物、浮游動物共同組成“微食物環(huán)”,在海洋生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)運輸與能量傳遞中起到承上啟下作用,是參與海洋生物地球化學(xué)循環(huán)不可或缺的一環(huán)。因此,了解海洋微生物的多樣性、群落結(jié)構(gòu)及其功能顯得尤為重要。已有的研究主要集中在自然海域微生物的群落特征,對海水養(yǎng)殖區(qū)尤其是大型海藻栽培區(qū)微生物群落特征所知甚少。為揭示大型海藻栽培區(qū)微生物群落結(jié)構(gòu)及功能,本研究以廣東省汕頭市南澳島龍須菜栽培區(qū)和相鄰自然海區(qū)(對照區(qū))為調(diào)查海域,通過采集不同季節(jié)、不同水深的樣品,提取DNA并進行16S rRNA MiSeq高通量測序及功能基因芯片(GeoChip)雜交,比較了大型海藻龍須菜栽培區(qū)和對照區(qū)微生物群落差異,分析了龍須菜體表附生微生物組成及功能,旨在探討龍須菜規(guī)模栽培對微生物群落的影響及其分子機理。所獲結(jié)論對海洋環(huán)境保護和生物資源可持續(xù)利用具有重要科學(xué)意義。主要研究結(jié)果如下:1.于2014年4月,在南澳島深澳灣龍須菜栽培區(qū)和對照區(qū)各設(shè)置3個采樣點。每個采樣點均采集表層水體、底層水體和沉積物,提取DNA并純化后,進行16S rRNA基因Mi Seq測序。結(jié)果顯示,18個樣品共產(chǎn)生超過530,000條高質(zhì)量序列,生成3454個OTU(Operational Taxonomic Units),分別屬于28個門,74個綱,134個目,275個科,618個屬。群落差異性檢驗(adonis)結(jié)果表明,龍須菜栽培區(qū)和對照區(qū)表層水體微生物群落結(jié)構(gòu)差異不明顯,但底層水體和沉積物中微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著(p0.05)。在表層和底層水體中,擬桿菌、α-變形菌和γ-變形菌均為優(yōu)勢菌,其相對豐度在栽培區(qū)和對照區(qū)中有差異。沉積物中優(yōu)勢菌為擬桿菌、γ-變形菌和ε-變形菌。在屬水平上,栽培區(qū)表層水體中Aestuariibacter,Crocinitomix,Leucothrix(亮發(fā)菌屬)及Tenacibaculum(黃桿菌屬)的相對豐度高于對照區(qū)(p0.05)。底層水體中,栽培區(qū)Aestuariibacter,Bacillariophyta(硅藻門)和Croceitalea的相對豐度高于對照區(qū)(p0.05)。沉積物中,Arenibacter,Glaciecola,Halomonas(鹽單胞菌屬),Leisingera(亮發(fā)菌屬),Maribacter,Peredibacter和Sulfitobacter(亞硫酸桿菌)在龍須菜栽培區(qū)的相對豐度高于對照區(qū)(p0.05)。大型海藻栽培區(qū)相對豐度高的微生物種屬與利用海藻多糖的微生物密切相關(guān),例如Arenibacter,Croceitalea,Glaciecola,Leucothrix和Maribacter。響應(yīng)比分析表明,栽培區(qū)表層和底層水體中顯著變化的OTU分別有89.9%和72%增加了相對豐度;栽培區(qū)沉積物中顯著變化的OTU有84.5%降低了相對豐度。CCA結(jié)果顯示,栽培區(qū)水體微生物群落結(jié)構(gòu)變化與溫度、DO、pH和Chl-a相關(guān),而對照區(qū)水體微生物群落結(jié)構(gòu)變化與鹽度和總氮密切相關(guān)。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明,表層及底層水體中顯著變化的OTU與溫度、pH和DO正相關(guān)(p0.01),與鹽度和總氮負相關(guān)(p0.01)。沉積物中顯著變化的OTU與總氮、總硫正相關(guān)(p0.01),與總碳負相關(guān)(p0.01)。對上述結(jié)果綜合分析,提出了龍須菜栽培對微生物影響的概念模型:龍須菜栽培可以提高水中溶解氧,降低營養(yǎng)鹽,從而改善水質(zhì),對微生物群落結(jié)構(gòu)演變產(chǎn)生影響。該模型為研究大型海藻與微生物相互作用奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。2.為進一步研究龍須菜栽培對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響,于2014年12月至2015年7月在龍須菜栽培區(qū)和對照區(qū)進行每月一次的連續(xù)采樣調(diào)查,對微生物樣品進行16S rRNA基因MiSeq測序,探討龍須菜生長對微生物群落動態(tài)變化的影響。利用adonis進行群落差異性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)采樣時間、龍須菜生物量變化及水深均對微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著影響(p0.01);同樣,龍須菜栽培、采樣時間對不同水層微生物群落結(jié)構(gòu)亦有顯著影響(p0.05)。Adonis分析發(fā)現(xiàn),龍須菜栽培區(qū)與對照區(qū)水體微生物群落結(jié)構(gòu)在1-2月(p0.05)和4-5月(p0.01)均有顯著差異,尤其是1米深和底層水體。NMDS分析結(jié)果表明,微生物群落在不同月份形成不同聚類,說明龍須菜栽培時間導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)差異。利用線性回歸分析α-多樣性與栽培時間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)栽培區(qū)表層水體微生物群落隨著龍須菜栽培生物量的增加而降低,其余水層及對照區(qū)均無線性關(guān)系。而且,微生物群落α-多樣性與龍須菜生物量呈負相關(guān),說明龍須菜對栽培區(qū)表層水體微生物群落具有一定的選擇作用,使得栽培區(qū)的微生物群落結(jié)構(gòu)趨于簡單�；贐ray-Curtis距離分析了龍須菜栽培區(qū)和對照區(qū)微生物群落結(jié)構(gòu)隨著龍須菜栽培時間的變化,結(jié)果表明,表層水體中兩者微生物群落結(jié)構(gòu)差異隨栽培時間而增加(p0.05),1米深及底層水體無線性增加關(guān)系。線性回歸分析結(jié)果表明,龍須菜栽培區(qū)和對照區(qū)表層、1米和底層水體微生物群落β-多樣性均隨著龍須菜生物量的增加而增加,且龍須菜栽培區(qū)表層和1米深水體微生物群落β-多樣性增加得更快,說明龍須菜栽培加快了微生物群落的演替速率。CCA結(jié)果顯示,龍須菜生長初期(1-3月)微生物群落結(jié)構(gòu)與DO、NO_3~-、NO_2~-、TP正相關(guān),龍須菜生物量較大時(4-5月)微生物群落結(jié)構(gòu)與pH、TN正相關(guān),說明龍須菜栽培改變了微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子,龍須菜栽培對微生物群落結(jié)構(gòu)及組成具有選擇性,并驅(qū)動了微生物群落演替加快。3.為研究龍須菜規(guī)模栽培對微生物群落功能的影響,于2014年12月-2015年7月分別采集了龍須菜栽培區(qū)和對照區(qū)1米水體,利用功能基因芯片GeoChip5.0分析微生物群落功能隨龍須菜栽培時間的變化情況。同時,于2015年5月采集了龍須菜栽培區(qū)和對照區(qū)表層、1米、水深一半、水深75%及底層水體,利用GeoChip 5.0分析龍須菜栽培對微生物群落功能的影響。結(jié)果顯示,龍須菜栽培區(qū)和對照區(qū)的微生物群落功能隨著龍須菜生物量的增加而出現(xiàn)顯著差異,尤其是在龍須菜生物量較大的四月和五月。栽培區(qū)氮循環(huán)中nrfA,nir,nasA基因豐度增加,基因amoA豐度降低,提高了生態(tài)系統(tǒng)中NH_4~+的含量,有利于龍須菜的吸收利用。同時,龍須菜栽培改變了不同水層微生物群落功能特征,尤其是1米及底層水體。1米深水體微生物群落參與碳降解及有機污染物修復(fù)的大多數(shù)基因在龍須菜栽培區(qū)的信號強度低于對照區(qū)。環(huán)境因子在影響微生物群落功能上起到重要作用。功能基因的改變、龍須菜生物量、環(huán)境因子及其相互作用可能反映了大型海藻-微生物-環(huán)境之間的復(fù)雜關(guān)系,龍須菜栽培能夠調(diào)控微生物群落功能,微生物群落功能的時空變化為揭示海水養(yǎng)殖對微生物群落功能影響提供了科學(xué)依據(jù)。4.為研究龍須菜體表附生微生物群落的結(jié)構(gòu)及功能,于2015年4月采集南澳島深澳灣新鮮龍須菜藻體,利用16S rRNA和ITS擴增子測序、功能基因芯片GeoChip 5.0等高通量技術(shù)對龍須菜體表和龍須菜周圍水體微生物群落進行了比較。群落差異性檢驗表明兩者在細菌群落結(jié)構(gòu)、真菌群落結(jié)構(gòu)及群落功能上均有顯著差異(p0.05)。龍須菜體表微生物群落的多樣性(Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù))均低于周圍水體,但均勻度(Simpson均勻度)高于周圍水體,說明龍須菜體表微生物群落結(jié)構(gòu)更加單一。測序結(jié)果表明,與藻類相關(guān)、具有溶藻特性及降解海藻多糖能力的微生物類群在龍須菜體表遠多于周圍水體,如Croceitalea,Formosa,Granulosicoccus(顆粒狀球菌屬),Leucothrix,Polaribacter(極地桿菌屬),Aureobasidium(短梗霉)。GeoChip 5.0分析表明,多數(shù)參與生物地球化學(xué)循環(huán)的基因在龍須菜體表微生物群落豐度較低,但是同化氮還原,硫/硫化物氧化及除草劑相關(guān)的基因在體表群落有較高豐度。此外,重金屬解毒、植物激素、干旱脅迫、生物膜形成等與海藻表面生活相關(guān)的基因在體表微生物群落中表現(xiàn)出較高豐度,說明為適應(yīng)海藻體表生活,龍須菜體表微生物群落保留或選擇了特定種類和功能類群。綜上所述,龍須菜規(guī)模栽培對微生物群落結(jié)構(gòu)具有重要影響。栽培區(qū)水體、沉積物及龍須菜體表中有關(guān)海藻及可利用海藻多糖的微生物種屬明顯多于自然海區(qū),龍須菜對微生物群落結(jié)構(gòu)及功能具有較強的選擇性。通過本研究,揭示了微生物在龍須菜栽培生態(tài)系統(tǒng)生物地球化學(xué)循環(huán)中的作用,論證了龍須菜體表附生微生物對龍須菜正常生長的重要性,提出了龍須菜規(guī)模栽培對微生物群落影響的概念模型,闡釋了其相互作用的分子機理。所獲結(jié)論為揭示海水養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S968.434
【圖文】：

24icrobial community composition in surface water (a), bottom water (b) and sevel. *: p < 0.05, **: p < 0.01 by ANOVA test.層水體(a)、底層水體(b)及沉積物(c)中微生物群落組成在屬水平的差異分p < 0.01)

Fig. 2-7 Significantly changed OTUs in surface water (a), bottom water (b) and sediment (c) atGZ analyzed by response ratio at 95% confidence interval.圖 2-7 龍須菜栽培區(qū)表層水體(a)、底層水體(b)和沉積物(c)中顯著變化 OTU 的響應(yīng)比分析The phylogenetic tree revealed the characteristics and distribution patterns ofdominant microbial groups (relative abundance > 1%) in the water column andsediment at both zones using the neighbor-joining method of MEGA 5. In the surfacewater, OTUs belonging to Aestuariibacter, Crocinitomix, Polaribacter,Tenacibaculum, unclassified Flavobacteriaceae and unclassified-Microbacteriaceaeexhibited higher abundances (p < 0.05) at GZ than at CZ (Fig. 2-8). In the bottomwater, OTUs belonging to Aestuariibacter, Bacillariophyta and Haliea showed higherabundances (p < 0.05) at GZ compared to CZ (Fig. 2-9). The OTUs in sedimentaffiliated with Arenibacter, Glaciecola, Leisingera, Sulfitobacter and Peredibacter

暨南大學(xué)博士學(xué)位論文 大型海藻龍須菜栽培生態(tài)系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)及功能研究At 1-m depth water samples, positive relationships were observed between PO43-,temperature, salinity, or pH and cultivation time, while there were negativerelationships between DO and cultivation time (p < 0.05). The increase in rates ofPO43-, temperature, and pH were greater in GW1m than in CW1m. However, theslopes of salinity and DO of CW1m were steeper than that of GW1m (Fig. 3-2). Inbottom water samples, PO43-, temperature, salinity and pH showed a positiverelationship with cultivation time, while the DO had a negative correlation withcultivation time (p < 0.05). Among these regressions between environmental factorsand cultivation time, the slopes of PO43-and pH in GWB were steeper compared toCWB. The slopes of temperature and salinity in GWB were flatter than those of CWB(p < 0.05) (Fig. 3-3).

本文編號：2772909