【摘要】：魚類作為水生生物,在其生命周期中會面臨大幅度的溫度變化,而低溫壓力會對魚類生理、行為造成顯著影響,甚至導(dǎo)致死亡。低溫馴化可以增強(qiáng)魚類對低溫的耐受能力。因此探索魚類低溫馴化的分子調(diào)控機(jī)制具有重要的意義。表觀遺傳在動植物適應(yīng)環(huán)境壓力的過程中起到了重要的作用。但是表觀遺傳在魚類低溫馴化中的作用并沒有進(jìn)行深入研究,特別是關(guān)于組蛋白修飾的研究很少,而關(guān)于長非編碼RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)方面的研究還是空白。斑馬魚作為一種常用的模式生物,其最適生長溫度為28.5℃,而野生型斑馬魚要經(jīng)歷大幅度波動的日常(5.6℃)和季節(jié)性(15.0±0.4℃)溫度變化,可以適應(yīng)大幅度的溫度變化(6-38℃)。因此斑馬魚也常用來研究魚類對溫度變化的適應(yīng)機(jī)制。課題組前期通過甲基化DNA免疫共沉淀測序(Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing,Me DIP-Seq)的方法發(fā)現(xiàn)斑馬魚胚胎成纖維細(xì)胞ZF4在低溫馴化過程中,DNA甲基化水平發(fā)生了明顯的改變,并且可能參與調(diào)控抗氧化、凋亡、發(fā)育、染色質(zhì)修飾、免疫系統(tǒng)等與低溫馴化相關(guān)的生物過程。通過比較低溫馴化前后斑馬魚胚胎成纖維細(xì)胞ZF4的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),課題組發(fā)現(xiàn)低溫壓力導(dǎo)致斑馬魚細(xì)胞多種表觀酶的表達(dá)都發(fā)生明顯轉(zhuǎn)變,包括組蛋白甲基化酶KMT2、KMT7,組蛋白去甲基化酶jmjd4、KDM4A、KDM6b,組蛋白乙�；竐p300,組蛋白去乙酰化酶HDAC8、HDAC11。另外,通過染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin Immuno-Precipitation,Ch IP)結(jié)合q PCR的方法也發(fā)現(xiàn)與寒冷適應(yīng)相關(guān)的p53、selenbp1等基因啟動子區(qū)域的組蛋白修飾也發(fā)生了轉(zhuǎn)變。這表明DNA甲基化、組蛋白修飾確實(shí)參與了低溫適應(yīng)的過程。本研究通過RNA-seq和染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)合高通量測序(Ch IP-seq)的方法來檢測斑馬魚細(xì)胞ZF4在低溫馴化前后lnc RNAs和組蛋白修飾在整個基因組的變化情況,進(jìn)而探索lnc RNAs和組蛋白修飾在低溫馴化過程中的調(diào)控機(jī)制。主要結(jié)果如下:1、為篩選鑒定斑馬魚中響應(yīng)低溫壓力的lnc RNAs,本研究分別提取正常培養(yǎng)條件(28°C)和低溫馴化(18°C 30天)后的斑馬魚胚胎成纖維細(xì)胞ZF4的總RNA進(jìn)行高通量測序。重新組裝轉(zhuǎn)錄本后,去除其中已知的m RNAs、lnc RNAs,并且去除長度小于200nt,開放閱讀框大于300或具有編碼潛能的轉(zhuǎn)錄本。按照如上標(biāo)準(zhǔn)鑒定出8363個新的lnc RNAs。在這些新的lnc RNAs中有62%定位在基因間區(qū),27%定位在內(nèi)含子區(qū)域。對這些新的lnc RNAs與已知m RNAs的一些特點(diǎn)進(jìn)行比較,超過89%的lnc RNAs的外顯子少于或等于2個,而超過86%的m RNAs的外顯子都多于2個。超過70%的lnc RNAs的長度都要小于1kb,只有大約33%的m RNAs的長度小于1kb。lnc RNAs和m RNA的中位FPKM值分別為0.9和2.6。表明這些lnc RNAs外顯子較少、長度較短、表達(dá)量較低。通過比較低溫馴化前后lnc RNAs(包括新鑒定的lnc RNAs和已有注釋的lnc RNAs)的表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)有347個lnc RNAs表達(dá)上調(diào),342個lnc RNAs表達(dá)下調(diào)。這些差異表達(dá)的lnc RNAs與臨近基因(假定的順式靶基因)的表達(dá)大多都呈現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系。對這些臨近基因中差異表達(dá)的部分進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組的百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,GO富集結(jié)果顯示顯著富集的生物過程包括ATP合成耦合電子傳遞,細(xì)胞粘附,細(xì)胞遷移,氧化還原過程,橫紋肌組織發(fā)育和多細(xì)胞生物體發(fā)育等,顯著富集的KEGG通路包括氧化磷酸化、黏著斑、間隙連接、鈣信號通路等。另外,根據(jù)lnc RNAs和m RNAs相互作用所需要的自由能,預(yù)測了差異表達(dá)最顯著的20個lnc RNAs的反式靶基因,并根據(jù)相互作用構(gòu)建了互作網(wǎng)絡(luò)圖。通過q PCR對差異表達(dá)的lnc RNAs和基因進(jìn)行驗(yàn)證,q PCR結(jié)果與RNA-seq的結(jié)果顯示出良好的一致性,說明RNA-seq數(shù)據(jù)是可靠的。另外,本研究也通過q PCR探索了低溫馴化后的細(xì)胞在回復(fù)至正常培養(yǎng)條件之后,4個lnc RNAs和tp53基因的表達(dá)變化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在恢復(fù)至正常培養(yǎng)條件后,tp53基因的表達(dá)量又逐漸降低,在7天的時(shí)候已經(jīng)與正常培養(yǎng)條件下的表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異,MSTRG.2788.1也是7天恢復(fù)至正常水平,而NONDRET001625.2、MSTRG2629.2則在3天的時(shí)候就沒有明顯的差異。MSTRG.28882.1在7天的時(shí)候仍呈現(xiàn)出低表達(dá)的狀態(tài)。這提示,不同的lnc RNAs可能受到調(diào)控的機(jī)制并不相同,它們恢復(fù)至正常水平所需要的時(shí)間也呈現(xiàn)出明顯的差異�？偟膩碚f,低溫壓力導(dǎo)致斑馬魚細(xì)胞中的lnc RNAs的表達(dá)譜發(fā)生明顯改變,本部分研究的結(jié)果為進(jìn)一步探索lnc RNAs在魚類適應(yīng)低溫壓力中的作用奠定基礎(chǔ)。2、為研究組蛋白修飾在參與斑馬魚應(yīng)對低溫壓力時(shí)發(fā)揮的作用。該部分研究同樣選用正常培養(yǎng)(28℃)和低溫馴化(18℃30天)的斑馬魚細(xì)胞ZF4作為實(shí)驗(yàn)材料,使用針對H3K4me3、H3K9me3、H3K27ac、H3K27me3等組蛋白修飾的抗體進(jìn)行Ch IP-seq實(shí)驗(yàn)。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)這幾種修飾在低溫壓力下都發(fā)生了不同程度的變化,例如H3K4me3、H3K9me3總體水平降低,而H3K27ac、H3K27me3總體升高;經(jīng)過低溫馴化后H3K4me3、H3K27ac、H3K27me3在基因啟動子區(qū)域的峰的比例都有所下降,而H3K27me3下降的最為明顯,其富集度降低的位點(diǎn)中,啟動子區(qū)域的比例超過了50%,富集度升高的位點(diǎn)在啟動子區(qū)域的比例不到10%�；蚣患治�(Gene set enrichment analysis,GSEA)結(jié)果顯示H3K4me3、H3K9me3、H3K27ac與基因表達(dá)呈明顯的正相關(guān),而H3K27me3與基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。表明這些組蛋白修飾確實(shí)參與了低溫壓力的基因表達(dá)調(diào)控。通過比較各染色體上基因表達(dá)水平和差異富集組蛋白修飾的分布,我們發(fā)現(xiàn)4號染色體長臂表達(dá)量明顯偏低,而且在低溫處理之后這些基因的表達(dá)水平整體出現(xiàn)降低。Chip-seq數(shù)據(jù)顯示,該區(qū)域明顯缺失H3K4me3與H3K27ac,并且H3K9me3、H3K27me3出現(xiàn)富集,呈現(xiàn)出異染色質(zhì)化的狀態(tài)。在低溫處理之后,H3K4me3、H3K9me3與H3K27ac富集度整體下降,而H3K27me3出現(xiàn)升高。提示該區(qū)域整體基因表達(dá)下調(diào)受到組蛋白修飾的調(diào)控。為驗(yàn)證Ch IP-seq實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性,分別在kdm4aa、tnfb、ccnd2a等基因的啟動子和基因上設(shè)計(jì)引物,通過Ch IP-q PCR進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果顯示Ch IP-q PCR與Ch IP-seq結(jié)果一致。對可能受到差異富集的這四種組蛋白修飾近距離調(diào)控的基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。結(jié)果顯示這四種組蛋白修飾所對應(yīng)的生物過程或者通路只有較少的重疊,這提示不同的組蛋白修飾可能受到不同的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。GO富集結(jié)果顯示:H3K4me3富集度降低的區(qū)域所在的基因大都和離子運(yùn)輸相關(guān),H3K4me3正調(diào)控的生物過程包括核小體組裝、染色質(zhì)沉默、防御革蘭氏陽性菌等;H3K27ac下調(diào)相關(guān)基因所涉及的生物過程包括負(fù)調(diào)控細(xì)胞遷移、正調(diào)控細(xì)胞增殖、MHC介導(dǎo)的抗原處理等,H3K27ac上調(diào)相關(guān)基因所涉及的生物過程大都和核糖體生物發(fā)生相關(guān);受H3K27me3調(diào)控的基因大都和發(fā)育相關(guān),另外它也參與了血管發(fā)生過程;受H3K9me3調(diào)控的基因也大都和發(fā)育相關(guān),另外它也參與調(diào)控離子穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)泛素化等過程。4種組蛋白修飾參與調(diào)控的通路包括MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、Fox O信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、p53信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等,在很多斑馬魚冷壓力相關(guān)研究中也觀察到這些通路相關(guān)基因表達(dá)水平發(fā)生變化。通過觀察H3K27ac調(diào)控的基因所在的通路發(fā)現(xiàn),雖然H3K27ac升高可能增強(qiáng)了p53信號通路的激活,但是凋亡相關(guān)通路中多個基因(casp3a、casp7等)啟動子區(qū)域的H3K27ac水平卻出現(xiàn)下降,而且這些基因表達(dá)水平也大都呈現(xiàn)出下降趨勢。這可能是斑馬魚細(xì)胞在抑制細(xì)胞增殖的同時(shí)又抑制凋亡,從而適應(yīng)低溫環(huán)境的一種方式。根據(jù)典型增強(qiáng)子和超級增強(qiáng)子所具有的組蛋白修飾特點(diǎn),本研究也分別預(yù)測了與冷馴化相關(guān)的典型增強(qiáng)子和超級增強(qiáng)子。通過比較兩類增強(qiáng)子臨近基因的表達(dá)變化,我們發(fā)現(xiàn)超級增強(qiáng)子具有更強(qiáng)的影響基因表達(dá)的作用。通過對超級增強(qiáng)子的靶基因(距離增強(qiáng)子最近的基因)進(jìn)行GO和KEGG富集分析來探索遠(yuǎn)距離的基因表達(dá)調(diào)控所涉及的生物功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)顯著富集的生物過程包括以DNA為模板的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、體節(jié)發(fā)生、血管發(fā)生、淋巴管發(fā)生等,顯著富集的通路包括MAPK信號通路、斑點(diǎn)黏連、VEGF信號通路、Wnt信號通路等。血管發(fā)生相關(guān)基因增強(qiáng)子元件位置的H3K27ac富集水平升高,而H3K27me3的富集水平卻出現(xiàn)下降。提示斑馬魚可能通過調(diào)控這兩種組蛋白修飾來激活VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,促進(jìn)血管發(fā)生,增強(qiáng)氧氣擴(kuò)散,以滿足低溫壓力下的氧氣需求。該部分研究揭示了組蛋白修飾在斑馬魚冷馴化中的潛在作用,完善了表觀遺傳在斑馬魚冷馴化中的調(diào)控機(jī)制,為下一步深入探索表觀遺傳在魚類冷馴化中的作用和調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4
【圖文】：

圖 1-1 3C 及其衍生技術(shù)原理Figure 1-1. Principles of 3C and its derivative technology4.5 增強(qiáng)子研究的應(yīng)用基因或者增強(qiáng)子的易位與反轉(zhuǎn)可能會導(dǎo)致異常的增強(qiáng)子與啟動子的接觸，進(jìn)可能引發(fā)異常的表型，如人類疾病。比如前腦無裂畸形的病人中出現(xiàn) SHH 位點(diǎn)

圖 2-1 新 lncRNAs 的鑒定和特點(diǎn)分析 （A）鑒定 lncRNAs 的工作流程。括號中的值顯示的是轉(zhuǎn)錄本的數(shù)目。（B）新 lncRNAs 在基因組上的分布。（C-E）mRNAs 和新 lncRNAs 之間外顯子數(shù)目、轉(zhuǎn)錄本長度和表達(dá)水平的比較。Figure 2-1. Identification and characterization of lncRNAs. (A) Workflow for identification oflncRNAs. The value in parentheses shows the number of transcripts. (B) The distribution of novellncRNAs on whole genome. (C-E) Comparison of exon numbers, transcript lengths, and expression

軸突延伸和啟動子區(qū)域 RNA 聚合酶 II 的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等；富集到的信號通路包括 Wnt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，ECM-受體互作，葉酸 碳單位以及抗生素的生物合成等。為了更好的展現(xiàn) lncRNAs 和反式作用 mRNAs 的互作，我們將自由能小于-50的 lncRNAs 和 mRNAs 挑選出來繪制出互作網(wǎng)絡(luò)圖。圖 2-3D 顯示出 個 lncRNA可能調(diào)控多個靶基因而 個靶基因也可能受多個 lncRNAs 的調(diào)控。

【參考文獻(xiàn)】

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1 區(qū)又君;;低溫冰凍災(zāi)害對我國南方漁業(yè)生產(chǎn)的影響、存在問題和建議[J];中國漁業(yè)經(jīng)濟(jì);2008年04期

本文編號：2771802