發(fā)布時(shí)間：2020-07-22 11:50

【摘要】：變形假單胞菌是重要的水產(chǎn)病原菌,近年來(lái)給海水養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了重大的經(jīng)濟(jì)損失。變形假單胞菌的致病性與海水溫度密切相關(guān),發(fā)病溫度范圍在15-20℃。為探究變形假單胞菌致病性溫度依賴的分子機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)室前期測(cè)定了不同溫度下變形假單胞菌的轉(zhuǎn)錄組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)變形假單胞菌的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子基因L321_20267的表達(dá)水平在18℃顯著地高于28℃,qRT-PCR也驗(yàn)證了這一結(jié)果,因此猜測(cè)L321_20267基因與變形假單胞菌毒力有關(guān)。為研究L321_20267基因與變形假單胞菌毒力的關(guān)系,本文設(shè)計(jì)并合成了5對(duì)針對(duì)L321_20267基因的shRNA序列,用本實(shí)驗(yàn)室改造的pCM130/tac質(zhì)粒來(lái)構(gòu)建重組質(zhì)粒,結(jié)果發(fā)現(xiàn)所構(gòu)建的變形假單胞菌5個(gè)突變株的L321_20267基因都被顯著沉默,其中突變株L321_20267-shRNA882減少量最高達(dá)到90.63%。以變形假單胞菌L321_20267-RNAi(L321_20267-shRNA882)沉默株感染斜帶石斑魚(yú)比野生株感染斜帶石斑魚(yú)的死亡率下降了50%,斜帶石斑魚(yú)開(kāi)始出現(xiàn)死亡的時(shí)間延遲了以及脾臟白點(diǎn)病癥狀也減輕了。取變形假單胞菌L321_20267-RNAi沉默株和野生株感染斜帶石斑魚(yú)24h的脾臟進(jìn)行RNA-seq比較分析。L321_20267基因的沉默導(dǎo)致了脾臟的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)水平也發(fā)生了重大的變化。GO和KEGG分析的結(jié)果表明變形假單胞菌L321_20267基因引起了宿主脾臟中絲氨酸水解酶、抗原處理和呈遞通路、B細(xì)胞受體信號(hào)通路和趨化因子信號(hào)通路的基因發(fā)生了顯著的變化。同時(shí),宿主免疫基因分別與不同數(shù)目的miRNA和lncRNA相關(guān)聯(lián),一些miRNA可能調(diào)控多個(gè)基因。本文的研究結(jié)果表明:1、L321_20267是變形假單胞菌的一個(gè)毒力基因。2、宿主免疫通路的上調(diào)使石斑魚(yú)更加的容易殺死L321_20267-RNAi沉默株變形假單胞菌。3、免疫基因的表達(dá)受到miRNA和lncRNA復(fù)雜的調(diào)控。
【學(xué)位授予單位】：集美大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S943
【圖文】：

圖 2-1 質(zhì)粒 pCM130/tac 圖譜1）挑單菌落：含有四環(huán)素的平板固體 LB 培養(yǎng)基中落。（2）搖菌培養(yǎng)：?jiǎn)尉浣臃N到 30mLLB 液體在 0.5 左右。（3）質(zhì)粒提�。�1、取 OD600值為 0.5

圖 2-2 變形假單胞菌基因 L321_20267 在不同溫度下的表達(dá)情況表誤差范圍，* P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001（下同）。質(zhì)粒測(cè)序測(cè)序公司所測(cè)得的測(cè)序結(jié)果顯示在圖 2-3 中。圖中均能找到一

RNA提取后的瓊脂糖凝膠電泳圖

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