【摘要】：擬穴青蟹(Scylla paramamosain)是中國東南沿海地區(qū)主要的蟹類養(yǎng)殖品種之一,其養(yǎng)殖總產(chǎn)量隨著養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展而逐年增長。但近年來以青蟹呼腸孤病毒(MCRV)和青蟹雙順反子病毒-1(MCDV-1)為主要病原的青蟹病毒病頻發(fā),嚴重威脅青蟹養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。番石榴葉作為中草藥的一種,其提取物中具有多種降血糖、抗菌、抗病毒及抗氧化作用的生物活性成份,該研究以不同濃度番石榴葉水提取物(Guava leaf water-extract,GLWE)藥浴擬穴青蟹,觀察其對青蟹成活率、免疫功能的影響及抗MCRV的作用,并通過轉(zhuǎn)錄組學方法探究其對青蟹免疫功能和抗病能力影響的分子生物學機制,為后續(xù)開發(fā)一種蟹用免疫增強劑做理論準備。首先通過預實驗確定了正式實驗中青蟹的養(yǎng)殖水體鹽度為10、密度為10-15只/m~2,且養(yǎng)殖水體中的非離子氨濃度不應超過0.63mg·L~(-1)。之后采用靜水法研究不同濃度番石榴水提取物對擬穴青蟹的成活率及血清中酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、酚氧化酶(PO)和一氧化氮合成酶(TNOS、iNOS)活力的影響,并初步探究GLWE的適宜用藥濃度范圍。結果表明,實驗15 d,各處理組青蟹的成活率隨著GLWE濃度的增高呈先升后降的現(xiàn)象且與C0組差異顯著(P0.05),其中C40組的成活率最高(55.56%),C0組的成活率最低(22.22%)。用藥12 h,C80組的AKP、CAT、PO、iNOS活力均顯著高于C0組(P0.05);用藥24 h,C20和C40組的SOD、LZM及C40組的ACP、CAT和PO活力均顯著高于C0組(P0.05);用藥48 h,C10、C20組的CAT活力及C40、C80的TNOS和iNOS活力均顯著高于C0組(P0.05);用藥72 h,其他各組的AKP活力均顯著高于C0組(P0.05),但C40組、C80組的ACP和CAT活力顯著低于C0組(P0.05)。該條件下,10-40 mg·L~(-1)的GLWE可在48 h內(nèi)顯著促進擬穴青蟹血清AKP、ACP、SOD、CAT、PO、NOS、LZM活力的升高,其中以20-40 mg·L~(-1)的GLWE效果最優(yōu)。然后再選取相同濃度的GLWE對自然和人工感染青蟹呼腸孤病毒(MCRV)的青蟹進行藥浴,采集相同時間點的各組青蟹肝胰腺進行病毒的定量驗證,結果表明自然感染組的MCRV在12 h大量增殖,其中C0與C10組的病毒拷貝數(shù)持續(xù)升高,并在24 h達到峰值且拷貝數(shù)均超過1×10~7 copies/ng RNA;而C20和C40組的病毒拷貝數(shù)則在12 h達到峰值,之后開始急速下降,至48 h,C20和C40組的病毒拷貝數(shù)始終低于C0組一個數(shù)量級;C80組的病毒拷貝數(shù)除在24 h低于C0組外,一直處于C0組水平;至72 h,拷貝數(shù)的排序依次為C10C80C0C20C40。人工感染組的MCRV在24 h內(nèi)的變化趨勢相似,均在6 h快速增殖,至12 h達到一個小高峰后轉(zhuǎn)為下降,至24 h又恢復到原來水平;之后,C0組的病毒拷貝數(shù)急速升高,并在72 h達到最高值且拷貝數(shù)達到1×10~6 copies/ng RNA;C80組的病毒拷貝數(shù)在24 h后再次升高,至72 h達到最高水平;C20和C40組的病毒拷貝數(shù)變化較平穩(wěn);至72 h,病毒拷貝數(shù)排序依次為C0C80C20C40。說明GLWE對自然或人工感染下MCRV的增殖都具有一定的抑制作用,且這種抑制作用具有一定的藥物濃度差異性,其中以20-40 mg/L~(-1)的GLWE效果最優(yōu)。最后以40 mg·L~(-1)的GLWE藥浴擬穴青蟹24 h,通過高通量測序構建了青蟹肝胰腺cDNA文庫并找到一些與青蟹的生長、免疫防御與應答等相關的通路或者差異表達基因,選取CAT、SOD、LZM、P50和FADS6基因進行定量驗證,結果顯示CAT、SOD、LZM、IκBα和FADS6基因的表達量明顯上調(diào),分別是對照組的2.18、3.14、5.13、2.66和2.65倍;P50基因的表達量則相對于對照組下調(diào),同時該文庫還得到了大量的SSR序列,可以為微衛(wèi)星標記研究下的擬穴青蟹種質(zhì)資源的調(diào)查、種群分布等生態(tài)學研究提供數(shù)據(jù)支持。綜上,可說明GLWE適合作為青蟹免疫增強劑的主要成分進行更進一步的研究。
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4
【圖文】：

氨氮濃度/mg·L-1死亡率/% mortality rate24 h 48 h對照組(Control group)<0.02)0 040.00 3.33 23.3360.00 26.67 43.3380.00 33.33 66.67100.00 40.00 83.33120.00 60.00 100.00140.00 76.67 100.00經(jīng)線性回歸方程求得，氨氮對青蟹 24 h、48 h 的 LC50 分別為 104.793、66.124mg·L-1，其 SC 為 7.90 mg·L-1。并由上式 (1)、 (2)計算得非離子氨對青蟹 24 h 的LC50為 8.396mg·L-1，對青蟹 48 h 的 LC50為 5.298 mg·L-1，對應的 SC 為 0.63 mg·L-1（圖 1-1）。

18圖 2-1 番石榴葉水提取物對擬穴青蟹血清免疫相關酶活力的影響Fig.2-1 Effects of GLWE on related immune enzyme activity in serum of S.paramamosain注：圖中大寫字母代表同一時間點各組間差異，小寫字母代表同組內(nèi)各時間點差異，其中相同字母間代表差異不顯著，不同字母間代表差異顯著（P<0.05）； * 代表同一時間點處理組與對照組（C0）差異極顯著（P<0.01），下同。Note：Capital letters in the figure represent differences between groups at the same time, the lowercase indicate thedifference of the times in the same group, among which the same letters indicate not significant difference, but thedifferent letters indicate significant (P<0.05)； * indicates very significant difference between the control group(C0)and treatment groups at the same time.

TaqR 0.2ssH2O 3.375cDNA 1Total 10n 探針 PCR 法的反應程序：95 ℃ 10 sec95 ℃ 5 sec60 ℃ 20 sec40 cycle70 ℃ 1 sec析實時熒光定量 PCR 標準曲線的繪制質(zhì)�？截悢�(shù)的 lg 值為 X 軸，以 Cq 值為 Y 軸，建立標準曲線

【參考文獻】

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本文編號：2759593