【摘要】：青海湖位于青藏高原東北部,是高原最大的內陸咸水湖泊,分布著青海湖特有的青海湖裸鯉(Gymnocypris przewalski)。青海湖裸鯉生活在高鹽(9ppt)、高pH(9.0—9.5)、高海拔(平均3260米)的青海湖。鯽魚(Carassius auratus)分布十分廣泛,全國各地水域都有生產,為我國重要的食用魚類之一。鯽魚是低氧耐受能力最強的淡水魚之一,是唯一能在室內不依賴氣泵而長期生存的魚類。低氧誘導因子-1α亞基(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)通常被認為是許多低氧誘導反應的主要開關,在缺氧環(huán)境中HIF-1α穩(wěn)定且表達升高。青海湖裸鯉HIF-1α的ODDD功能域中的羥化酶識別位點的保守序列為:PEMLAP(550-555),與其它脊椎動物保守序列(LXXLAP,X代表任意氨基酸)不符,其脯氨酸羥化保守序列中的第550位氨基酸由Pro代替了在其它所有脊椎動物中的Leu,可影響青海湖裸鯉HIF-1α的穩(wěn)定,推測可能參與對鹽堿湖環(huán)境的適應,使青海湖裸鯉具有與普通魚類不同的堿性水環(huán)境適應機制。為了探究HIF-1對魚類堿性環(huán)境適應的影響,本研究主要運用轉錄組測序技術、熒光定量PCR、Western Blot和流式細胞分析等實驗技術對青海湖裸鯉和鯽魚展開研究,具體內容如下:1.轉錄組測序分析將捕獲的青海湖裸鯉分別進行相應處理后取肝臟組織,提取總RNA,利用Illumina Hiseq高通量測序技術對采取的組織進行轉錄組測序,獲得序列數(shù)據(jù)堿基數(shù)在3800973300-6587446200 bp之間,將高質量數(shù)據(jù)通過從頭組裝生成重疊群和單一序列進行后續(xù)分析。通過與NR庫的比對分析有33785個序列與鯉魚序列相近,其余相近序列能在14個物種中找到,而17179個序列是對比不到近源物種,屬于未知物種;通過對COG分類統(tǒng)計圖分析發(fā)現(xiàn)青海湖裸鯉肝臟的許多轉錄本有信號轉導機制、復制、重組和修復、翻譯后修飾,蛋白質轉化率,分子伴侶、細胞骨架等功能。同時KOG分類統(tǒng)計圖中發(fā)現(xiàn)也有很多轉錄本對信號轉導機制、次生代謝產物的生物合成、運輸和分解代謝、轉錄等方面發(fā)揮功能。轉錄組測序可以從基因的水平上全面的分析不同組之間的區(qū)別,同時為后續(xù)青海湖裸鯉的有關研究奠定基礎。2.關鍵基因的差異性表達分析對轉錄組測序結果進行統(tǒng)計分析,對關鍵基因進行熒光定量PCR。從金華花鳥市場購買鯽魚,分為中性生理鹽水組(pH 7.4,注射生理鹽水)、堿性生理鹽水組(pH 9.0-9.5,注射生理鹽水)、堿性DMOG組(pH 9.0-9.5,注射DMOG 8mg/kg),處理后取肝臟組織,對關鍵基因進行熒光定量PCR。首先通過對HIF-1靶基因VEGF在不同組中的相對含量,表明了HIF-1α參與青海裸鯉和鯽魚對堿性環(huán)境的應答。其次,發(fā)現(xiàn)青海裸鯉和鯽魚三羧酸循環(huán)和糖酵解途徑中的關鍵基因參與堿性環(huán)境的適應,其中TCA循環(huán)關鍵酶PDK1和糖酵解關鍵酶PFK mRNA表達水平均顯著高于中性環(huán)境,增強糖酵解途徑并抑制三羧酸循環(huán),促進裸鯉和鯽魚對堿性環(huán)境下體內高氨水平的適應。第三,發(fā)現(xiàn)堿性環(huán)境處理抑制裸鯉與鯽魚谷胺酰胺途徑中的關鍵基因GS和鯽魚GDH表達水平,并激活鯽魚GPT酶活。表明HIF-1通過影響Gln代謝參與調節(jié)裸鯉與鯽魚對堿性環(huán)境的應答。最后,不同處理脂肪代謝途徑關鍵基因沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異。3.相關生理生化指標的測定和細胞增殖與凋亡分析對青海湖裸鯉和鯽魚進行血氨含量的測定,發(fā)現(xiàn)堿性處理會使得鯽魚血氨濃度顯著上升,而DMOG處理導致鯽魚血氨濃度在堿性環(huán)境下能夠顯著下降。而相比較裸鯉各組并沒有顯著差異,表明裸鯉的耐氨能力強于鯽魚。谷丙轉氨酶(GPT)活性和還原性輔酶II(NADPH)合成速率的測定分析發(fā)現(xiàn)堿性環(huán)境處理會使得鯽魚肝臟GPT的酶活性明顯提高,DMOG處理后會使得鯽魚GPT酶活性顯著升高,說明堿性環(huán)境會對氨基酸代謝途徑的關鍵酶GPT的酶活性產生影響。通過比較中性環(huán)境組(NN)、堿性環(huán)境+生理鹽水組(AN)、堿性環(huán)境+DMOG組(AD)鯽魚的還原性輔酶II含量發(fā)現(xiàn),DMOG處理堿性環(huán)境誘導的鯽魚肝臟組織NADPH合成速率的降低,顯示在鯽魚對高氨環(huán)境的應答反應中,HIF-1對Gln代謝的影響有所差異,這與基因的差異性表達分析結果一致。對293T細胞和草魚CIK細胞進行氨處理,檢測高氨對細胞增殖和凋亡的影響及HIF-1的作用。CCK-8分析發(fā)現(xiàn)隨著氨濃度的增加,細胞增殖能力減弱,細胞受到的毒性越大。采用流式細胞儀Annexin V-FITC和PI雙染檢測細胞凋亡,結果顯示氨濃度處理的實驗組,細胞凋亡率顯著增加,而加了1mM DMOG實驗組凋亡率有所下降,可見HIF-1的穩(wěn)定減輕了高氨對細胞的損傷。
【學位授予單位】：浙江師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S917.4
【圖文】：

HIF的結構

圖 1 HIF 的結構Fig.1 Structure of HIF1.2 HIF-1α 表達的調節(jié)在常氧的情況下，HIF- α 亞基的半衰期很短，細胞不斷合成和降解蛋白質[12氧濃度對α亞基降解的調控是通過ODDD域中兩個脯酰胺殘基（Pro402和Pro56的羥基化實現(xiàn)的。羥基化反應由脯酰胺羥化酶（prolyl hydroxylase, PHDs）催化，活性取決于氧、2-酮戊二酸和輔因子 Fe2+的水平[13,14]。脯氨酸的羥基化使 HIF-1亞基與腫瘤抑制基因蛋白（von Hippel-Lindau tumor suppressor, pVHL）相互作用并通過泛素蛋白酶體通路被降解[15]。在氧濃度下降時脯氨�；u基化受到抑制穩(wěn)定的 HIF-1α 向細胞核內轉移并與 HIF-1β 形成 HIF-1 二聚體，然后與目的基因表達調控區(qū)域的低氧應答元件結合，調節(jié)靶基因的表達[16,17](圖 2)。Pro402 和Pro564 在魚類 HIF-1α 中保守，推測這種調節(jié)機制也同樣存在于魚類中。

篩選差異表達基因。我們的研究為未來研究裸鯉對環(huán)境適應進化史提供了豐富的基因組資源。和低氧對魚類生理指標的影響的生存介質，水環(huán)境質量的良好是保證魚類健康生長的重要的魚類生長發(fā)育要求的水質必須在物理、化學、生物等方面都適著舉足輕重的作用[66]。目前對于酸性環(huán)境對魚的呼吸和代謝環(huán)性水環(huán)境對鯽魚的代謝途徑以及適應機制的研究還不多[67]。指標，高 pH 環(huán)境會嚴重抑制魚類含氮廢物的排出[68]。魚類主擴散的方式排出含氮廢物，不需要額外消耗能量，排尿素動物通過尿素循環(huán)排出含氮廢物，因此蛋白質代謝途徑在魚類能量于陸地哺乳動物[69]。

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本文編號：2759108