【摘要】：青海湖位于青藏高原東北部,是高原最大的內(nèi)陸咸水湖泊,分布著青海湖特有的青海湖裸鯉(Gymnocypris przewalski)。青海湖裸鯉生活在高鹽(9ppt)、高pH(9.0—9.5)、高海拔(平均3260米)的青海湖。鯽魚(Carassius auratus)分布十分廣泛,全國各地水域都有生產(chǎn),為我國重要的食用魚類之一。鯽魚是低氧耐受能力最強(qiáng)的淡水魚之一,是唯一能在室內(nèi)不依賴氣泵而長期生存的魚類。低氧誘導(dǎo)因子-1α亞基(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)通常被認(rèn)為是許多低氧誘導(dǎo)反應(yīng)的主要開關(guān),在缺氧環(huán)境中HIF-1α穩(wěn)定且表達(dá)升高。青海湖裸鯉HIF-1α的ODDD功能域中的羥化酶識(shí)別位點(diǎn)的保守序列為:PEMLAP(550-555),與其它脊椎動(dòng)物保守序列(LXXLAP,X代表任意氨基酸)不符,其脯氨酸羥化保守序列中的第550位氨基酸由Pro代替了在其它所有脊椎動(dòng)物中的Leu,可影響青海湖裸鯉HIF-1α的穩(wěn)定,推測(cè)可能參與對(duì)鹽堿湖環(huán)境的適應(yīng),使青海湖裸鯉具有與普通魚類不同的堿性水環(huán)境適應(yīng)機(jī)制。為了探究HIF-1對(duì)魚類堿性環(huán)境適應(yīng)的影響,本研究主要運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)、熒光定量PCR、Western Blot和流式細(xì)胞分析等實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)青海湖裸鯉和鯽魚展開研究,具體內(nèi)容如下:1.轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析將捕獲的青海湖裸鯉分別進(jìn)行相應(yīng)處理后取肝臟組織,提取總RNA,利用Illumina Hiseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)采取的組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,獲得序列數(shù)據(jù)堿基數(shù)在3800973300-6587446200 bp之間,將高質(zhì)量數(shù)據(jù)通過從頭組裝生成重疊群和單一序列進(jìn)行后續(xù)分析。通過與NR庫的比對(duì)分析有33785個(gè)序列與鯉魚序列相近,其余相近序列能在14個(gè)物種中找到,而17179個(gè)序列是對(duì)比不到近源物種,屬于未知物種;通過對(duì)COG分類統(tǒng)計(jì)圖分析發(fā)現(xiàn)青海湖裸鯉肝臟的許多轉(zhuǎn)錄本有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、復(fù)制、重組和修復(fù)、翻譯后修飾,蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率,分子伴侶、細(xì)胞骨架等功能。同時(shí)KOG分類統(tǒng)計(jì)圖中發(fā)現(xiàn)也有很多轉(zhuǎn)錄本對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、運(yùn)輸和分解代謝、轉(zhuǎn)錄等方面發(fā)揮功能。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以從基因的水平上全面的分析不同組之間的區(qū)別,同時(shí)為后續(xù)青海湖裸鯉的有關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。2.關(guān)鍵基因的差異性表達(dá)分析對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行熒光定量PCR。從金華花鳥市場購買鯽魚,分為中性生理鹽水組(pH 7.4,注射生理鹽水)、堿性生理鹽水組(pH 9.0-9.5,注射生理鹽水)、堿性DMOG組(pH 9.0-9.5,注射DMOG 8mg/kg),處理后取肝臟組織,對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行熒光定量PCR。首先通過對(duì)HIF-1靶基因VEGF在不同組中的相對(duì)含量,表明了HIF-1α參與青海裸鯉和鯽魚對(duì)堿性環(huán)境的應(yīng)答。其次,發(fā)現(xiàn)青海裸鯉和鯽魚三羧酸循環(huán)和糖酵解途徑中的關(guān)鍵基因參與堿性環(huán)境的適應(yīng),其中TCA循環(huán)關(guān)鍵酶PDK1和糖酵解關(guān)鍵酶PFK mRNA表達(dá)水平均顯著高于中性環(huán)境,增強(qiáng)糖酵解途徑并抑制三羧酸循環(huán),促進(jìn)裸鯉和鯽魚對(duì)堿性環(huán)境下體內(nèi)高氨水平的適應(yīng)。第三,發(fā)現(xiàn)堿性環(huán)境處理抑制裸鯉與鯽魚谷胺酰胺途徑中的關(guān)鍵基因GS和鯽魚GDH表達(dá)水平,并激活鯽魚GPT酶活。表明HIF-1通過影響Gln代謝參與調(diào)節(jié)裸鯉與鯽魚對(duì)堿性環(huán)境的應(yīng)答。最后,不同處理脂肪代謝途徑關(guān)鍵基因沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異。3.相關(guān)生理生化指標(biāo)的測(cè)定和細(xì)胞增殖與凋亡分析對(duì)青海湖裸鯉和鯽魚進(jìn)行血氨含量的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)堿性處理會(huì)使得鯽魚血氨濃度顯著上升,而DMOG處理導(dǎo)致鯽魚血氨濃度在堿性環(huán)境下能夠顯著下降。而相比較裸鯉各組并沒有顯著差異,表明裸鯉的耐氨能力強(qiáng)于鯽魚。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活性和還原性輔酶II(NADPH)合成速率的測(cè)定分析發(fā)現(xiàn)堿性環(huán)境處理會(huì)使得鯽魚肝臟GPT的酶活性明顯提高,DMOG處理后會(huì)使得鯽魚GPT酶活性顯著升高,說明堿性環(huán)境會(huì)對(duì)氨基酸代謝途徑的關(guān)鍵酶GPT的酶活性產(chǎn)生影響。通過比較中性環(huán)境組(NN)、堿性環(huán)境+生理鹽水組(AN)、堿性環(huán)境+DMOG組(AD)鯽魚的還原性輔酶II含量發(fā)現(xiàn),DMOG處理堿性環(huán)境誘導(dǎo)的鯽魚肝臟組織NADPH合成速率的降低,顯示在鯽魚對(duì)高氨環(huán)境的應(yīng)答反應(yīng)中,HIF-1對(duì)Gln代謝的影響有所差異,這與基因的差異性表達(dá)分析結(jié)果一致。對(duì)293T細(xì)胞和草魚CIK細(xì)胞進(jìn)行氨處理,檢測(cè)高氨對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響及HIF-1的作用。CCK-8分析發(fā)現(xiàn)隨著氨濃度的增加,細(xì)胞增殖能力減弱,細(xì)胞受到的毒性越大。采用流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC和PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡,結(jié)果顯示氨濃度處理的實(shí)驗(yàn)組,細(xì)胞凋亡率顯著增加,而加了1mM DMOG實(shí)驗(yàn)組凋亡率有所下降,可見HIF-1的穩(wěn)定減輕了高氨對(duì)細(xì)胞的損傷。
【學(xué)位授予單位】：浙江師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S917.4
【圖文】：

HIF的結(jié)構(gòu)

圖 1 HIF 的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of HIF1.2 HIF-1α 表達(dá)的調(diào)節(jié)在常氧的情況下，HIF- α 亞基的半衰期很短，細(xì)胞不斷合成和降解蛋白質(zhì)[12氧濃度對(duì)α亞基降解的調(diào)控是通過ODDD域中兩個(gè)脯酰胺殘基（Pro402和Pro56的羥基化實(shí)現(xiàn)的。羥基化反應(yīng)由脯酰胺羥化酶（prolyl hydroxylase, PHDs）催化，活性取決于氧、2-酮戊二酸和輔因子 Fe2+的水平[13,14]。脯氨酸的羥基化使 HIF-1亞基與腫瘤抑制基因蛋白（von Hippel-Lindau tumor suppressor, pVHL）相互作用并通過泛素蛋白酶體通路被降解[15]。在氧濃度下降時(shí)脯氨�；u基化受到抑制穩(wěn)定的 HIF-1α 向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移并與 HIF-1β 形成 HIF-1 二聚體，然后與目的基因表達(dá)調(diào)控區(qū)域的低氧應(yīng)答元件結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[16,17](圖 2)。Pro402 和Pro564 在魚類 HIF-1α 中保守，推測(cè)這種調(diào)節(jié)機(jī)制也同樣存在于魚類中。

篩選差異表達(dá)基因。我們的研究為未來研究裸鯉對(duì)環(huán)境適應(yīng)進(jìn)化史提供了豐富的基因組資源。和低氧對(duì)魚類生理指標(biāo)的影響的生存介質(zhì)，水環(huán)境質(zhì)量的良好是保證魚類健康生長的重要的魚類生長發(fā)育要求的水質(zhì)必須在物理、化學(xué)、生物等方面都適著舉足輕重的作用[66]。目前對(duì)于酸性環(huán)境對(duì)魚的呼吸和代謝環(huán)性水環(huán)境對(duì)鯽魚的代謝途徑以及適應(yīng)機(jī)制的研究還不多[67]。指標(biāo)，高 pH 環(huán)境會(huì)嚴(yán)重抑制魚類含氮廢物的排出[68]。魚類主擴(kuò)散的方式排出含氮廢物，不需要額外消耗能量，排尿素動(dòng)物通過尿素循環(huán)排出含氮廢物，因此蛋白質(zhì)代謝途徑在魚類能量于陸地哺乳動(dòng)物[69]。

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本文編號(hào)：2759108