【摘要】：大菱鲆C-型凝集素(Sm Lec1)和Lily型凝集素(SmLTL)都是重要的免疫因子,具有重要的生理、生化及免疫功能,本文通過基因克隆、組織表達(dá)和蛋白重組等方法分析這兩種凝集素的活性特點(diǎn),以及環(huán)境脅迫對(duì)其表達(dá)調(diào)控的影響,探討這兩種凝集素在大菱鲆先天免疫應(yīng)答過程中的潛在功能以及養(yǎng)殖環(huán)境中的應(yīng)用具有重要的意義。1通過SmLTL的基因克隆、結(jié)構(gòu)分析和組織表達(dá),對(duì)其特性進(jìn)行分析,為大菱鲆Lily型凝集素的進(jìn)一步研究奠定理論基礎(chǔ)。通過RACE技術(shù)克隆得到大菱鲆Lily型凝集素的cDNA全長為569bp,包括編碼112個(gè)氨基酸的336bp開放閱讀框。根據(jù)組織的qPCR分析顯示,SmLTL mRNA的于皮膚,鰓,腸的表達(dá)量顯著,在其他組織的表達(dá)量不顯著。通過生物信息軟件隨其進(jìn)行分析,結(jié)果顯示:Sm LTL在第30-99個(gè)氨基酸處有兩個(gè)個(gè)甘露糖結(jié)合位點(diǎn)(QxDxNx VxY)和一個(gè)特殊位點(diǎn)TxTxGxRxV形成一個(gè)β-棱鏡架構(gòu)(x是任何氨基酸殘基1)。對(duì)Sm LTL的一級(jí),二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè),并通過生物工程軟件進(jìn)行分析,顯示Sm LTL蛋白質(zhì)是親水性蛋白,含有5.36%α-螺旋,39.29%延伸鏈,16.07%β-折疊和39.29%無規(guī)卷曲,有三個(gè)反式β-折疊,3個(gè)蛋白結(jié)合位點(diǎn)。2本研究通過環(huán)境脅迫實(shí)驗(yàn)、蛋白重組和凝集實(shí)驗(yàn),對(duì)SmLTL的功能展開深層次的研究,為大菱鲆疾病預(yù)防和控制新途徑打下基礎(chǔ)。通過環(huán)境脅迫對(duì)Sm LTL表達(dá)水平的調(diào)控實(shí)驗(yàn)(包括高溫和鹽度),結(jié)果顯示皮膚、腸和鰓具有顯著的變化。重組SmLTL蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中能夠凝集小鼠血細(xì)胞且沒有鈣依賴性,在D-甘露糖存在的情況下被抑制。另外,SmLTL表現(xiàn)出對(duì)愛德華氏菌和鰻弧菌的凝集活性。同時(shí)Sm LTL對(duì)纖毛蟲具有殺傷性作用,濃度為100μgml-1在24小時(shí)后能致死60%的的纖毛蟲。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)感染纖毛蟲后的SmLTL的鰓、皮膚和腸的mRNA表達(dá)量顯著增加。3通過對(duì)大菱鲆C-型凝集素進(jìn)行環(huán)境脅迫實(shí)驗(yàn)、蛋白重組和凝集實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步了解其功能特性,為大菱鲆C-型凝集素在實(shí)際生產(chǎn)和養(yǎng)殖中的應(yīng)用作為理論性指導(dǎo)基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)利用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組表達(dá),并通過純化獲得重組目的蛋白,活性分析結(jié)果顯示:重組C-型凝集素在所選6種細(xì)菌中對(duì)鰻弧菌和愛德華氏菌具有明顯的凝集作用;在選取的8種糖中木糖、果糖、蔗糖、乳糖和甘露糖能夠抑制SmLec1的凝集活性;理化因子PH和溫度均對(duì)SmLec1的凝集活性產(chǎn)生影響;鰻弧菌感染實(shí)驗(yàn)顯示,感染6h時(shí)SmLec1表達(dá)量明顯上升,在12h時(shí)達(dá)到最高值,隨后有所下降;溫度脅迫時(shí)肝組織的Sm Lec1mRNA表達(dá)量受到溫度的影響顯著,在19℃開始升高,22℃到27℃呈降低趨勢(shì),其他組織變化不顯著。鹽度脅迫時(shí)Sm Lec1在各鹽度的表達(dá)量變化不顯著。研究結(jié)果表明,SmLec1能夠抑制鰻弧菌的感染,其表達(dá)受到溫度的影響,本研究將為進(jìn)一步研究大菱鲆C-型凝集素蛋白的抗菌機(jī)理和探索對(duì)大菱鲆疾病的免疫學(xué)防治途徑提供科學(xué)依據(jù)。大菱鲆C-型和Lily型凝集素是重要的免疫因子,本文通過分析其活性特點(diǎn),并且首次通過大菱鲆環(huán)境脅迫對(duì)這兩種基因表達(dá)調(diào)控的影響分析實(shí)驗(yàn),探討這兩種凝集素在大菱鲆先天免疫應(yīng)答過程中的潛在功能以及養(yǎng)殖環(huán)境中的應(yīng)用。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S917.4
【圖文】：

圖2-2 SmLTL利用Kyte and Doolittle (1982)的方法進(jìn)行的疏水性分析圖。Fig. 2-2 SmLTL was hydrophilic analyzed by the method of Kyte and Doolittle (19822.3.2 SmLTL 基因的生物信息學(xué)分析2.3.2.1 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析SmLTL 的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示，該蛋白含有 5.36％的α螺旋，39.216.07％的β-卷曲和 39.29％的無規(guī)線圈。SmLTL 的氨基酸序列的信不含信號(hào)肽或跨膜區(qū)。SmLTL 蛋白在第 3 個(gè)氨基酸和 112 個(gè)氨基酸露糖結(jié)合凝集素（β-凝集素）結(jié)構(gòu)域（共有 109 個(gè)氨基酸）。在這個(gè)構(gòu)域中在第 30 個(gè)氨基酸 30 和 99 個(gè)氨基酸之間發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)甘露QxDxNxVxY 在三倍的特定基序顛倒內(nèi)部重復(fù)（β-棱鏡結(jié)構(gòu)）（圖 2-復(fù) 位 于 Gln30-ASP32-Asn34-Val36-Tyr38 ， 第 二 個(gè) 重 復(fù)Gln59-Asp61-Asn63-Val65-Tyr67，第 3 個(gè)（TxTxGxRxV）是位于 TGly95-Arg97-Val99。第三個(gè)重復(fù)在物種之間存在差異（圖 2-3）。

圖 2-3 SmLTL 與其他同源基因多序列比對(duì)：線鱧，斜帶石黑洘淕，虹鱒，條石鯛和鳙魚的 Lily 型凝集素。同源的 G三個(gè) D-甘露糖結(jié)合位點(diǎn)被突出顯示。Fig. 2-3 Multiple sequence alignment of SmLTL with other hChanna striata, Epinephelus coioides, Esox lucius, LarimLophiomus setigerus, Oncorhynchus mykiss, Oplegnathus faGenBank accession numbers of the homologous are givenD-mannose binding sites are highlighted.

圖 2-4 SmLTL 的三維結(jié)構(gòu)： β-片由箭頭指示，折疊Fig. 2-4 The three-dimensional structure of SmLTL. β-loops are indicated by lines.β 鏈，β 折疊， β 發(fā)夾圖 2-5 SmLTL 的二級(jí)結(jié)構(gòu)包括 10 個(gè)β鏈，14 個(gè)βbeta strand,β beta turn, beta hairpiFig. 2-5 Secondary structure of SmLTLcontained 10 β-str

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6 王W

本文編號(hào)：2756879