【摘要】：大菱鲆C-型凝集素(Sm Lec1)和Lily型凝集素(SmLTL)都是重要的免疫因子,具有重要的生理、生化及免疫功能,本文通過基因克隆、組織表達和蛋白重組等方法分析這兩種凝集素的活性特點,以及環(huán)境脅迫對其表達調(diào)控的影響,探討這兩種凝集素在大菱鲆先天免疫應答過程中的潛在功能以及養(yǎng)殖環(huán)境中的應用具有重要的意義。1通過SmLTL的基因克隆、結(jié)構(gòu)分析和組織表達,對其特性進行分析,為大菱鲆Lily型凝集素的進一步研究奠定理論基礎。通過RACE技術克隆得到大菱鲆Lily型凝集素的cDNA全長為569bp,包括編碼112個氨基酸的336bp開放閱讀框。根據(jù)組織的qPCR分析顯示,SmLTL mRNA的于皮膚,鰓,腸的表達量顯著,在其他組織的表達量不顯著。通過生物信息軟件隨其進行分析,結(jié)果顯示:Sm LTL在第30-99個氨基酸處有兩個個甘露糖結(jié)合位點(QxDxNx VxY)和一個特殊位點TxTxGxRxV形成一個β-棱鏡架構(gòu)(x是任何氨基酸殘基1)。對Sm LTL的一級,二級和三級結(jié)構(gòu)進行了預測,并通過生物工程軟件進行分析,顯示Sm LTL蛋白質(zhì)是親水性蛋白,含有5.36%α-螺旋,39.29%延伸鏈,16.07%β-折疊和39.29%無規(guī)卷曲,有三個反式β-折疊,3個蛋白結(jié)合位點。2本研究通過環(huán)境脅迫實驗、蛋白重組和凝集實驗,對SmLTL的功能展開深層次的研究,為大菱鲆疾病預防和控制新途徑打下基礎。通過環(huán)境脅迫對Sm LTL表達水平的調(diào)控實驗(包括高溫和鹽度),結(jié)果顯示皮膚、腸和鰓具有顯著的變化。重組SmLTL蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中能夠凝集小鼠血細胞且沒有鈣依賴性,在D-甘露糖存在的情況下被抑制。另外,SmLTL表現(xiàn)出對愛德華氏菌和鰻弧菌的凝集活性。同時Sm LTL對纖毛蟲具有殺傷性作用,濃度為100μgml-1在24小時后能致死60%的的纖毛蟲。同時我們發(fā)現(xiàn)感染纖毛蟲后的SmLTL的鰓、皮膚和腸的mRNA表達量顯著增加。3通過對大菱鲆C-型凝集素進行環(huán)境脅迫實驗、蛋白重組和凝集實驗,進一步了解其功能特性,為大菱鲆C-型凝集素在實際生產(chǎn)和養(yǎng)殖中的應用作為理論性指導基礎。實驗利用原核表達系統(tǒng)進行重組表達,并通過純化獲得重組目的蛋白,活性分析結(jié)果顯示:重組C-型凝集素在所選6種細菌中對鰻弧菌和愛德華氏菌具有明顯的凝集作用;在選取的8種糖中木糖、果糖、蔗糖、乳糖和甘露糖能夠抑制SmLec1的凝集活性;理化因子PH和溫度均對SmLec1的凝集活性產(chǎn)生影響;鰻弧菌感染實驗顯示,感染6h時SmLec1表達量明顯上升,在12h時達到最高值,隨后有所下降;溫度脅迫時肝組織的Sm Lec1mRNA表達量受到溫度的影響顯著,在19℃開始升高,22℃到27℃呈降低趨勢,其他組織變化不顯著。鹽度脅迫時Sm Lec1在各鹽度的表達量變化不顯著。研究結(jié)果表明,SmLec1能夠抑制鰻弧菌的感染,其表達受到溫度的影響,本研究將為進一步研究大菱鲆C-型凝集素蛋白的抗菌機理和探索對大菱鲆疾病的免疫學防治途徑提供科學依據(jù)。大菱鲆C-型和Lily型凝集素是重要的免疫因子,本文通過分析其活性特點,并且首次通過大菱鲆環(huán)境脅迫對這兩種基因表達調(diào)控的影響分析實驗,探討這兩種凝集素在大菱鲆先天免疫應答過程中的潛在功能以及養(yǎng)殖環(huán)境中的應用。
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4
【圖文】：

圖2-2 SmLTL利用Kyte and Doolittle (1982)的方法進行的疏水性分析圖。Fig. 2-2 SmLTL was hydrophilic analyzed by the method of Kyte and Doolittle (19822.3.2 SmLTL 基因的生物信息學分析2.3.2.1 二級結(jié)構(gòu)分析SmLTL 的二級結(jié)構(gòu)分析顯示，該蛋白含有 5.36％的α螺旋，39.216.07％的β-卷曲和 39.29％的無規(guī)線圈。SmLTL 的氨基酸序列的信不含信號肽或跨膜區(qū)。SmLTL 蛋白在第 3 個氨基酸和 112 個氨基酸露糖結(jié)合凝集素（β-凝集素）結(jié)構(gòu)域（共有 109 個氨基酸）。在這個構(gòu)域中在第 30 個氨基酸 30 和 99 個氨基酸之間發(fā)現(xiàn)了兩個甘露QxDxNxVxY 在三倍的特定基序顛倒內(nèi)部重復（β-棱鏡結(jié)構(gòu)）（圖 2-復 位 于 Gln30-ASP32-Asn34-Val36-Tyr38 ， 第 二 個 重 復Gln59-Asp61-Asn63-Val65-Tyr67，第 3 個（TxTxGxRxV）是位于 TGly95-Arg97-Val99。第三個重復在物種之間存在差異（圖 2-3）。

圖 2-3 SmLTL 與其他同源基因多序列比對：線鱧，斜帶石黑洘淕，虹鱒，條石鯛和鳙魚的 Lily 型凝集素。同源的 G三個 D-甘露糖結(jié)合位點被突出顯示。Fig. 2-3 Multiple sequence alignment of SmLTL with other hChanna striata, Epinephelus coioides, Esox lucius, LarimLophiomus setigerus, Oncorhynchus mykiss, Oplegnathus faGenBank accession numbers of the homologous are givenD-mannose binding sites are highlighted.

圖 2-4 SmLTL 的三維結(jié)構(gòu)： β-片由箭頭指示，折疊Fig. 2-4 The three-dimensional structure of SmLTL. β-loops are indicated by lines.β 鏈，β 折疊， β 發(fā)夾圖 2-5 SmLTL 的二級結(jié)構(gòu)包括 10 個β鏈，14 個βbeta strand,β beta turn, beta hairpiFig. 2-5 Secondary structure of SmLTLcontained 10 β-str

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本文編號：2756879