【摘要】：近些年因疾病爆發(fā)、生境破壞等諸多因素、特別是環(huán)境中病原微生物的影響,導(dǎo)致全球兩棲類種群數(shù)量呈銳減趨勢(shì),已引起了人們廣泛關(guān)注。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)作為機(jī)體識(shí)別病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP),在微生物侵襲時(shí),使機(jī)體啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答,從而激活一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)引發(fā)針對(duì)病原體的特異性免疫應(yīng)答。本研究以中國(guó)東北地區(qū)優(yōu)勢(shì)兩棲動(dòng)物東北林蛙(R.dybowskii)為研究對(duì)象,以蛙類易感病原微生物嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)為感染源,研究在嗜水氣單胞菌脅迫下東北林蛙體內(nèi)TLR4信號(hào)通路中核轉(zhuǎn)錄因子IRF3和IRF7的調(diào)控機(jī)制。本研究通過(guò)HE染色觀察Ah感染東北林蛙后其肝臟組織病理學(xué)變化,采用高通量測(cè)序獲得東北林蛙IRF3和IRF7序列設(shè)計(jì)引物,熒光定量PCR檢測(cè)在Ah脅迫下其肝、心、腎、脾組織中TLR4信號(hào)通路中IRF3和IRF7 mRNA表達(dá)變化,為探明東北林蛙被細(xì)菌感染后其體內(nèi)TLR4通路的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:Ah感染后肝臟組織病理學(xué)觀察所見,隨著時(shí)間延長(zhǎng)(12～72 h),肝細(xì)胞變性,呈空泡樣變,細(xì)胞間隙增大,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸明顯。熒光定量PCR結(jié)果顯示:東北林蛙TLR4信號(hào)通路中IRF3 mRNA在肝、心、腎、脾組織中均呈上調(diào)表達(dá),在12h達(dá)峰值;IRF7 mRNA在肝、心、腎、脾組織均呈上調(diào)表達(dá),且在腎、心中于12h達(dá)峰值,在脾、肝臟中則分別在24h和72h達(dá)到峰值。此外,IRF3 mRNA在腎臟和脾臟中上調(diào)表達(dá)峰值明顯高于心臟和肝臟,其中尤以脾臟變化最為明顯,為對(duì)照組的13.7倍(p＜0.01);IRF7 mRNA表達(dá)量在脾臟中變化最明顯,為對(duì)照組的13倍(p＜0.01),其次在腎臟中表達(dá)量為對(duì)照組的9倍(p＜0.01),在肝臟中表達(dá)量最低,為對(duì)照組的1.3倍。本研究結(jié)果表明,嗜水氣單胞菌對(duì)東北林蛙具有致病性,IRF3、IRF7參與了 TLR4信號(hào)通路的固有免疫應(yīng)答。
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S947.2
【圖文】：

在７ｈ之前，ＯＤ值與活菌數(shù)量的增長(zhǎng)呈正相關(guān)，在７ｈ之后，分光光度儀所測(cè)的數(shù)逡逑值沒(méi)有太大的波動(dòng)，趨近于平緩，而活菌計(jì)數(shù)法表明此時(shí)細(xì)胞己經(jīng)出現(xiàn)了自溶的現(xiàn)象，逡逑或者有毒物質(zhì)累積導(dǎo)致菌液中有大量死亡的細(xì)菌和細(xì)胞碎片，呈下降趨勢(shì)（圖３－１），而逡逑這一現(xiàn)象在生長(zhǎng)曲線沒(méi)有顯示，說(shuō)明活菌計(jì)數(shù)法更能準(zhǔn)確的反映細(xì)菌生長(zhǎng)趨勢(shì)。逡逑？邋ＣＦＵ邋▲＿邋ＱＤ逡逑ＩＳ「邐ｉ邐１邋２，７逡逑￣邋0３逡逑「ｊ邋Ｉ邋Ｔ邋＞邋．邋Ｉ邋■邋Ｉ邋■邋Ｉ邋＿邋■邋■邋Ｉ邋■邋■邋■邋■邋■邋Ｉ邋■雪■邋Ｉ邋■邋Ｉ邋■邋Ｉ邋■邋Ｉ邋■■尨邋Ｉ邋Ｑ逡逑１．５邋２．Ｓ邋３．Ｄ邋４．５邋５．５邋Ｇ．Ｓ邋７．５邋１０逡逑生長(zhǎng)時(shí)間／Ｈ逡逑圖３－１嗜水氣單胞菌生長(zhǎng)曲線逡逑Ｆｉｇ邋３－１邋Ａｅｒｏｍｏｎａｓ邋ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｃｕｒｖｅ逡逑３．２東北林蛙形態(tài)觀察逡逑３．２．１解剖學(xué)觀察逡逑東北林蛙感染嗜水氣單胞菌后表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)遲緩、趾部紅腫并逐步蔓延至腿部。解剖逡逑學(xué)觀察其腹腔積水，肝臟、腎臟、脾臟充血腫脹。其中尤以肝臟組織病變最為明顯（圖逡逑３－２）。逡逑ｒ逡逑－１６－逡逑

逡逑圖３－２嗜水氣單胞菌感染東北林蛙解剖圖逡逑Ｆｉｇ３－２邋ａｎａｔｏｍｙ邋ｃｈａｒｔ邋ｏｆ邋Ｒａｎｃｉ邋ｄｙｂｏｗｓｋｉｉ邋ｗｉｔｈ邋Ａｅｒｏｍｏｎａｓ邋ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ邋ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ逡逑３．２．２肝臟病理組織切片逡逑用ＬＢ培養(yǎng)基稀釋對(duì)數(shù)期菌液至１邋ｘ邋１邋0７ＣＦＵ／ｍＬ邋Ａｈ組腹腔注射１邋ｍｌ菌液，其他對(duì)照組逡逑注射等量ＬＢ培養(yǎng)基、ＬＰＳ溶液。逡逑如圖３－３所示，與對(duì)照組（ＬＢ）相比較，１２邋ｈ邋Ａｈ組肝竇擴(kuò)張、瘀血（圖３－３－Ｂ），逡逑ＬＰＳ組局部有出血點(diǎn)，色素沉積（圖３－３－Ｃ）；邋２４ｈＡｈ組中央靜脈擴(kuò)張，局部有空泡（圖３－逡逑３－Ｂ，），ＬＰＳ組肝竇擴(kuò)張，其間充滿大量血細(xì)胞（圖３－３－Ｑ）；邋４８ｈＡｈ組細(xì)胞排列紊亂，色逡逑素沉淀，局部有瘀血（圖３－３－Ｂ２）；邋ＬＰＳ組細(xì)胞間隙增大，出現(xiàn)大量的紅細(xì)胞浸潤(rùn)（圖逡逑３－３－Ｃ２）；邐７２ｈ邋Ａｈ組部分細(xì)胞核破裂溶解，細(xì)胞之間界限不清，呈空泡樣變（圖３－３－逡逑Ｂ３）；邋ＬＰＳ組肝細(xì)胞破裂，細(xì)胞核固縮、破裂溶解，肝組織出現(xiàn)廣泛性炎癥出血（圖３－逡逑３－Ｃ３）0逡逑ＬＢ邋（ｃｏｎｔｒｏｌ）邐Ａｈ＋ＬＢ邐ＬＰＳ＋ＬＢ逡逑１２ｈ邐Ｖ

３．３總ＲＮＡ提取結(jié)果逡逑１．５％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總ＲＮＡ質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)樣品總ＲＮＡ邋ＯＤ值。逡逑結(jié)果顯示：ＯＤ２６0／ＯＤ２８0比值在１．８－２．０之間，ＯＤ２６0／ＯＤ２３ｑ比值在１．８－２．２之間，圖３－４是逡逑部分總ＲＮＡ電泳圖，各樣本可見２８Ｓ、１８ＳＲＮＡ條帶清晰，說(shuō)明ＲＮＡ沒(méi)降解，無(wú)蛋白逡逑和其他污染，也無(wú)有機(jī)物／鹽離子污染。質(zhì)量符合ｑＰＣＲ要求，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。逡逑１邐２邐３邐４邋５邐６邐７邋８＾逡逑圖３－４總ＲＮＡ電泳圖（１、２代表肝臟，３、４代表心臟，５、６代表腎臟，７、８代表脾臟ＲＮＡ）逡逑Ｆｉｇ．３－４邋Ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ（１邋ａｎｄ邋２邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｔｈｅ邋ｌｉｖｅｒ，邋３邋ａｎｄ邋４邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｔｈｅ邋ｈｅａｒｔ，邋５邋ａｎｄ邋６邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｔｈｅ逡逑ｋｉｄｎｅｙｓ，邋７邋ａｎｄ邋８邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｔｈｅ邋ｓｐｌｅｅｎ邋ＲＮＡ）逡逑３．４邋ＲＴ－ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果逡逑由東北林蛙總ＲＮＡ反轉(zhuǎn)錄成ｃＤＮＡ，用Ｂｅａｃｏｎ邋Ｄｅｓｉｇｎｅｒ邋７設(shè)計(jì)的６對(duì)引物分別進(jìn)逡逑行目的基因ＩＲＦ３／ＩＲＦ７的ＰＣＲ擴(kuò)增，所得明亮清晰的單一條帶，且無(wú)引物二聚體（見逡逑圖３－５）。所測(cè)的片段大小與設(shè)計(jì)引物時(shí)需擴(kuò)增的長(zhǎng)度一致

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2756285