發(fā)布時間：2020-07-13 17:31

【摘要】：弧菌是海水養(yǎng)殖環(huán)境常見的病源菌,不僅是制約海水養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素,而且是威脅人類健康的食源性病原菌。抗生素藥物大量投加雖能一定程度上抑制弧菌增殖,但同時也誘導了一些耐藥弧菌的產(chǎn)生。近年來,多數(shù)研究顯示大型海藻不僅具有凈化水質(zhì)功能,且從中提取的物質(zhì)具有較強抗菌性,世界衛(wèi)生組織也曾推薦從海藻提取抗生物質(zhì)代替抗生素管理控制養(yǎng)殖病原菌問題。為進一步拓展大型海藻用于養(yǎng)殖水質(zhì)修復,有必要研究海藻活體組織對弧菌的抑制特性,相關的研究報道仍然較少。為此,本文以典型大型海藻裂片石莼和和三株弧菌(副溶血弧菌標準株ATCC17802、海水養(yǎng)殖環(huán)境分離的野生副溶血弧菌Vp1和溶藻弧菌Va2)為研究對象,重點從菌落可培養(yǎng)性、運動性和生物膜形成方面反映不同條件裂片石莼抑制作用下的弧菌生長活性,并通過轉錄組測序分析弧菌在藻作用后差異基因表達情況,以此揭示裂片石莼對海水養(yǎng)殖環(huán)境弧菌的抑制作用特性,主要研究結果如下:1.裂片石莼對弧菌可培養(yǎng)性抑制作用研究采用TCBS平板計數(shù)表征弧菌菌落可培養(yǎng)性,裂片石莼活體組織分別與三株弧菌共培養(yǎng),可顯著抑制副溶血弧菌標準株、副溶血弧菌Vp1和溶藻弧菌Va2的可培養(yǎng)性。在12g/L藻密度持續(xù)培養(yǎng)3d以上,菌落可培養(yǎng)性抑制率均達到99%左右。在不同藻密度方式下,研究發(fā)現(xiàn)高密度藻(12g/L)持續(xù)作用對弧菌可培養(yǎng)性的抑制作用明顯高于低密度藻(3g/L);菌懸液濃度越高時裂片石莼抑制作用下弧菌可培養(yǎng)零檢測所需的時間就越長。2.裂片石莼對弧菌運動性和生物膜成膜能力抑制作用研究采用改良的泳動平板、蹭行平板分別觀察弧菌泳動和蹭行行為,并用結晶紫染色法定量檢測弧菌的生物膜生成量。結果表明不同條件下(不同藻密度、氮磷水平、鹽度和菌懸液濃度)弧菌運動性和生物膜生成量明顯受到裂片石莼抑制。裂片石莼作用3d后,弧菌生物膜形成最大量時成膜能力均被抑制,副溶血弧菌標準株、副溶血弧菌Vp1和溶藻弧菌Va2分別在不同條件下獲得最高抑制率,分別為67.10%、94.69%和88.50%;裂片石莼對副溶血弧菌標準株、副溶血弧菌Vp1和溶藻弧菌Va2也分別在不同條件下獲得泳動行為最高抑制率,分別為30.29%、20.26%和39.49%,蹭行行為抑制率分別為47.68%、39.49和31.8%。整體而言,裂片石莼活培養(yǎng)物可以有效將弧菌可培養(yǎng)狀態(tài)轉變?yōu)椴豢膳囵B(yǎng)狀態(tài),并損害弧菌運動性及生物膜附著表面能力,且不同弧菌受裂片石莼抑制作用特性差異顯著。3.弧菌轉錄組測序分析采用Illumina HiSeq XTM Ten測序平臺對經(jīng)裂片石莼作用前后的副溶血弧菌Vp1和溶藻弧菌Va2進行RNA轉錄組測序分析。差異基因篩選結果顯示均有多個上調(diào)和下調(diào)基因,其中副溶血弧菌Vp1共得到210個顯著性差異基因,包括90個上調(diào)基因和120個下調(diào)基因。通過GO功能富集和KEGG通路分析,副溶血弧菌Vp1差異表達基因主要富集在鞭毛組裝、細菌趨化性和生物膜通路上,下調(diào)基因主要包括鞭毛蛋白FliC、鞭毛運動開關蛋白FliG和FliN、甲基接受趨化性蛋白MCP、趨化蛋白CheY和CheW等;溶藻弧菌Va2差異表達基因主要富集到嘧啶代謝、細菌趨化性和鞭毛組裝,下調(diào)基因有尿苷磷酸化酶、鞭毛馬達蛋白FliG。整體而言,這些基因的下調(diào)都與裂片石莼作用下弧菌運動性和生物膜成膜降低的結果對應。
【學位授予單位】：浙江海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S941.4
【圖文】：

圖 4-1 樣本基因表達分布圖Fig 4.1 Sample gene expression distribution顏色代表不同范圍的 rpkm 值，橫坐標為樣品，縱坐標為基因數(shù)量。因表達分析副溶血弧菌 Vp1 的樣本 HD2 和 CG2 進行差異基因篩選，分析得異基因，其中有 90 個顯著性差異的上調(diào)基因和 120 個顯著性差異 4-2 為樣本 HD2 和 CG2 差異表達基因的整體分布情況。通過對 HD3 和 CG3 進行差異基因篩選，分析得到 9 個顯著性差異基因異的上調(diào)基因和 8 個顯著性差異的下調(diào)基因。

45圖 4-2 差異基因表達火山分布圖Fig 4.2 Differential gene expression volcano map掉的非顯著性差異的基因，紅色和綠色為顯著性差異基用下副溶血弧菌 Vp1 轉錄組分析結果表達分析溶血弧菌 Vp1 共培養(yǎng) 24 h 后，通過對樣本 HD2 和顯著性差異基因中，與膜相關的差異基因如表 4

圖 4-3 副溶血弧菌 Vp1 轉錄組 GO 功能分類Fig 4.3 Gene ontology functional classification of Vibrio parahaemolyticus Vp1 transcriptome注：圖中不同顏色表示所有基因富集的 GO Level2 條目按功能的分類，橫軸為條目名稱，縱軸表示對應條目的基因數(shù)量和其百分比。按照 GO 富集顯著性，將生物學過程（BP）、細胞組分（CC）和分子功能（MF）3 大類別中富集程度較高的結果列于表 4-11。表 4-11 GO 富集分析結果Tab 4.11 GO enrichment analysis resultsGO accession description categoryGO:0009636 response to toxic substance Biological processGO:0009228 thiamine biosynthetic process Biological processGO:0009229 thiamine diphosphate biosynthetic process Biological processGO:0009405 pathogenesis Biological processGO:0009408 response to heat Biological processGO:0006099 tricarboxylic acid cycle Biological processGO:0005576 extracellular region Cellular componentGO:0005886 plasma membrane Cellular component

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本文編號：2753764