【摘要】：對(duì)蝦急性肝胰臟壞死病(acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND)2009年首次在中國(guó)暴發(fā),之后越南(2010),馬來(lái)西亞(2011),泰國(guó)(2012)和墨西哥(2013)菲律賓(2015)等地接連發(fā)生。這是一種細(xì)菌性疾病,患病對(duì)蝦死亡率極高(高達(dá)100%)。截止到2013年,AHPND給亞洲的對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了前所未有的危害,致使每年經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)10億美元,并且仍有進(jìn)一步擴(kuò)大的趨勢(shì)。2013年Lightner等研究發(fā)現(xiàn)引起AHPND的元兇是一種被噬菌體病毒感染后發(fā)生了變異的副溶血性弧菌。2015年臺(tái)灣的研究小組選擇自然缺失與實(shí)驗(yàn)刪除pirA和pirB毒力基因的突變株進(jìn)行試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)兩類(lèi)突變株致病能力均消除,為此進(jìn)一步證實(shí)PirA和PirB毒素是引起急性肝胰腺壞死病的最終病因。在現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)上,發(fā)展面向凡納濱對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病的高效診斷及防控技術(shù)研究,是減少AHPND疫情的風(fēng)險(xiǎn),使蝦農(nóng)受益的關(guān)鍵。本課題從AHPND的診斷入手,建立熒光原位雜交檢測(cè)方法,可視化的監(jiān)測(cè)環(huán)境及對(duì)蝦組織中的致病菌,進(jìn)一步證實(shí)本實(shí)驗(yàn)室保存的AHPND菌株具有致病性。其次是以該致病株為實(shí)驗(yàn)材料,并下載國(guó)際上其他地區(qū)AHPND致病株的管家基因信息,分析全球范圍內(nèi)AHPND致病菌的流行性和遺傳學(xué)關(guān)系。最后我們從基因型和表型兩方面研究AHPND致病菌的耐藥性,為促進(jìn)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù),這對(duì)我國(guó)的水產(chǎn)生態(tài)安全和經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。1.VP_(AHPND)熒光原位雜交檢測(cè)方法的建立本研究基于pirA基因設(shè)計(jì)熒光原位雜交探針,檢測(cè)引起對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病的副溶血性弧菌。通過(guò)序列比對(duì)軟件ClustalX發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有的pirA基因保守?zé)o突變,采用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)探針。探針核酸序列通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST選項(xiàng)初步檢驗(yàn)不匹配他種屬非AHPND菌株。為進(jìn)一步驗(yàn)證其特異性,選取21株非AHPND致病菌和12株AHPND致病菌進(jìn)行驗(yàn)證,FISH檢測(cè)可以鑒別出12個(gè)AHPND陽(yáng)性樣本,與PCR檢測(cè)方法結(jié)果一致。本研究設(shè)計(jì)的pirA探針與AHPND致病性的副溶血性弧菌雜交時(shí),熒光信號(hào)清晰,菌體形狀明顯。同時(shí)用pirA探針檢測(cè)患病對(duì)蝦肝胰腺切片時(shí)看到有明顯的致病菌存在。FISH可以用來(lái)檢測(cè)環(huán)境和蝦組織中的AHPND致病性的副溶血性弧菌。本研究將為更好地了解這些環(huán)境微生物對(duì)水產(chǎn)品的危害提供更多的工具。2.引起凡納濱對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病的副溶血弧菌MLST新序列型本研究針對(duì)不用地區(qū)急性肝胰腺壞死病致病性副溶血弧菌,運(yùn)用多位點(diǎn)測(cè)序技術(shù),分析了致病菌株的遺傳特征。實(shí)驗(yàn)選擇副溶血弧菌的7個(gè)管家基因dnaE、gyrB、recA、dtdS、pntA、pyrC及tnaA,對(duì)AHPND致病菌擴(kuò)增測(cè)序。將核酸序列上傳至PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)后獲得每株菌的序列型。同時(shí)收集不同地區(qū)AHPND致病性副溶血弧菌的MLST數(shù)據(jù),采用eBURST V3及MEGA 5.0軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果顯示中國(guó)廣東分離的AHPND致病菌屬于一個(gè)新序列型ST1710(42、134、99、79、141、41、51),僅與庫(kù)中ST415及ST975同源性較高。目前,急性肝胰腺壞死致病株的9種ST型可歸為2個(gè)克隆組和5個(gè)單體。經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)一步分析可知新序列型ST1710與單體ST975遺傳關(guān)系相近。AHPND序列型及其相關(guān)非AHPND序列型分離株均來(lái)自于環(huán)境,并且與養(yǎng)殖蝦類(lèi)密切相關(guān)。本研究首次報(bào)道中國(guó)AHPND分離株的序列型,豐富了PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù),并為其遺傳進(jìn)化研究奠定了理論基礎(chǔ)。3.中國(guó)廣東急性肝胰腺壞死病分離株的耐藥性研究論文第四章主要從基因型和表型兩方面研究AHPND致病菌的耐藥性,以期為監(jiān)測(cè)耐藥菌的出現(xiàn)提供幫助,這對(duì)我國(guó)的水產(chǎn)生態(tài)安全和經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。廣東分離到的AHPND致病性副溶血性弧菌對(duì)氨芐西林(AMP)耐藥。氨基糖苷類(lèi)(AK、CN、K、S),β-內(nèi)酰胺類(lèi)(AMC),頭孢類(lèi)(KZ)均有部分菌株中度敏感。其余則為比較敏感。其含耐藥基因種類(lèi)較少,僅攜帶氨基糖苷類(lèi)耐藥基因aadA2和磺胺類(lèi)耐藥基因sulⅠ,sulⅡ。因此本實(shí)驗(yàn)室分離獲得的AHPND致病株耐藥程度相對(duì)較低,對(duì)很多抗菌藥物的敏感性高,耐藥基因種類(lèi)較少。這在一定程度上也表明該養(yǎng)殖基地藥物使用情況良好,但因藥物中度敏感菌株較多,仍需繼續(xù)關(guān)注蝦類(lèi)藥物耐受情況。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S945.4
【圖文】：

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文研人員上傳的 AHPND pirA 毒力基因序列，其具體菌株及基因。所有菌株 pirA 毒力基因序列對(duì)比后可知目前所發(fā)現(xiàn)的 pirA 毒圖 2-2），因此可選擇其全長(zhǎng)進(jìn)行探針設(shè)計(jì)。將 pirA 毒力基因序remier 5 軟件設(shè)計(jì)探針，找出評(píng)分最高且無(wú)發(fā)夾結(jié)構(gòu)及錯(cuò)配的序irA 熒光原位雜交探針，根據(jù)表 2-1 中探針引物合成探針序列，于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

無(wú)突變（圖 2-2），因此可選擇其全長(zhǎng)進(jìn)行探針設(shè)計(jì)。將 pirA 毒力基因序列粘貼至Primer Premier 5 軟件設(shè)計(jì)探針，找出評(píng)分最高且無(wú)發(fā)夾結(jié)構(gòu)及錯(cuò)配的序列作為本實(shí)驗(yàn)的 pirA 熒光原位雜交探針，根據(jù)表 2-1 中探針引物合成探針序列，經(jīng)地高辛標(biāo)記后用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。圖 2-1 pirA 基因擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2-1 The PCR products of pirAM: 2000 bp Marker; C: Control; 1: F2; 2: F5; 3: F7;4: F11; 5: F12; 6: F14; 7: F18;8: F19;9: G9;10: G10;11: G11;12:G12.

2-3 副溶血性弧菌(a,b)ATCC33847 和 G10(c,d)的 pirA 雜交結(jié)io parahaemolyticusATCC33847(a,b) and G10(c,d)hybridized with 圖 2-4 對(duì)蝦肝胰腺中致病菌的檢測(cè)a：陰性對(duì)照；b：感染對(duì)蝦肝胰腺 Detection of pathogenic bacteria in hepatopancreas of Litopenaeus e control; b: The hepatopancreas from the shrimps challenged with V

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2750494