【摘要】：為探究凡納濱對(duì)蝦腸道黏膜的屏障作用,分別利用黃曲霉毒素B1(AFB1)和副溶血弧菌E1(VPE1)對(duì)凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn),從組織學(xué)及基因表達(dá)層面探究凡納濱對(duì)蝦腸道對(duì)毒素及弧菌的響應(yīng)機(jī)制,以期為對(duì)蝦的健康養(yǎng)殖、疾病防治提供理論依據(jù)。為探究AFB1對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道黏膜屏障的影響,以投喂含有15 mg/kg AFB1飼料的凡納濱對(duì)蝦作為實(shí)驗(yàn)組,不含AFB1飼料投喂的凡納濱對(duì)蝦作為對(duì)照組,分別于第2、4、8、12 d取腸道組織,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mTOR信號(hào)通路中的真核細(xì)胞起始因子4E結(jié)合蛋白(eif4ebp),真核翻譯起始因子1a(eif4e1a),真核翻譯起始因子2(eif4e2)和核糖體s6蛋白激酶(p70s6k)基因,與免疫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Dorsal和Relish基因,酚氧化酶原(proPO)基因以及黏蛋白樣圍食膜因子(mucin-like PM)基因表達(dá)水平的變化,利用組織切片技術(shù)探究AFB1對(duì)腸道組織形態(tài)的影響。結(jié)果表明,AFB1的添加會(huì)對(duì)mTOR通路相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生影響,實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦eif4ebp基因自第2 d起發(fā)生顯著上調(diào);eif4e2和eif4e1a基因皆在第8 d和第12 d被顯著抑制;p70s6k基因在第2 d和第4 d呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì),并于第12 d回升至初始水平。AFB1同時(shí)也刺激了免疫系統(tǒng)的響應(yīng),實(shí)驗(yàn)組Dorsal基因和Relish基因均被顯著誘導(dǎo);proPO基因于第4 d和第8 d顯著上調(diào)并于第12 d回落至初始水平;mucin-like PM基因在第2-8 d均顯著上調(diào)。AFB1的添加也破壞了凡納濱對(duì)蝦腸道正常的組織形態(tài),出現(xiàn)上皮細(xì)胞核肥大,邊緣模糊,上皮細(xì)胞層部分脫落等現(xiàn)象。結(jié)果表明,AFB1嚴(yán)重影響凡納濱對(duì)蝦腸道黏膜屏障的功能,不僅對(duì)腸道黏膜造成了機(jī)械損傷,同時(shí)對(duì)腸道化學(xué)屏障和免疫屏障產(chǎn)生了影響。利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNAseq)技術(shù)及生物信息學(xué)分析,探究了VPE1感染12 h時(shí)凡納濱對(duì)蝦腸道中與腸道黏膜屏障功能相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平的變化,結(jié)果表明:(1)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序原始數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控、拼接后,共得到164,420條Unigene,將Unigene與Nr,Nt等7大數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì),共有48542條Unigene注釋到至少一個(gè)數(shù)據(jù)庫中,占全部Unigene的29.52%;(2)利用DEseq進(jìn)行差異表達(dá)分析,得到差異表達(dá)的基因(Differentially expressed genes,DEGs)共4646個(gè),其中上調(diào)的基因有2469個(gè),下調(diào)的基因有2177個(gè);(3)從DEGs中鑒別出可能參與到凡納濱對(duì)蝦腸道黏膜屏障對(duì)VPE1感染響應(yīng)過程的基因,涉及到腸道黏膜的機(jī)械屏障、化學(xué)屏障和免疫屏障的相關(guān)功能,包括:圍食膜因子,細(xì)胞骨架和細(xì)胞連接,模式識(shí)別受體,抗菌肽與免疫信號(hào)通路,絲氨酸蛋白酶/蛋白酶抑制劑與酚氧化酶系統(tǒng),細(xì)胞凋亡與細(xì)胞吞噬,抗氧化系統(tǒng)等功能。(4)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)方法對(duì)15個(gè)DEGs進(jìn)行驗(yàn)證,驗(yàn)證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。利用組織切片和透射電鏡觀察VPE1浸浴后凡納濱對(duì)蝦腸道組織與細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明:(1)VPE1感染后,腸道上皮細(xì)胞層結(jié)構(gòu)被破壞,上皮細(xì)胞層與基膜分離;(2)透射電鏡結(jié)果表明,VPE1感染后,腸道上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,細(xì)胞連接被破壞,細(xì)胞間界限模糊;部分細(xì)胞的細(xì)胞核固縮,異染色質(zhì)聚集在核膜內(nèi)圍,溶酶體出現(xiàn)在細(xì)胞核附近;部分細(xì)胞微絨毛脫落,細(xì)菌進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部并被囊泡包裹,細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)空洞,有凋亡小體出現(xiàn)。同時(shí)電鏡觀察結(jié)果在一定程度上與RNAseq差異表達(dá)基因的結(jié)果相互印證。轉(zhuǎn)錄組、組織切片與電鏡結(jié)果表明,機(jī)械、化學(xué)及免疫屏障參與到凡納濱對(duì)蝦腸道對(duì)VPE1感染的響應(yīng)過程中,在凡納濱對(duì)蝦腸道抵御弧菌感染的過程中發(fā)揮重要作用。上述結(jié)果有助于理解凡納濱對(duì)蝦腸道對(duì)弧菌及毒素的響應(yīng)機(jī)制,可為對(duì)蝦腸道黏膜屏障研究提供理論依據(jù),所獲得的大量轉(zhuǎn)錄本可為未來對(duì)蝦基因組學(xué)的研究提供參考,為新基因的發(fā)現(xiàn)提供豐富的數(shù)據(jù)資源。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院海洋研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S945.49
【圖文】：

圖 2.1 飼料中添加 AFB1 對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道四種營養(yǎng)相關(guān)基因表達(dá)的影響（a）eif4ebp,（b）eif4e1a,（c）eif4e2,（d）p70s6k；不同字母代表在不同時(shí)間點(diǎn)之間基因存在顯著性差異，*代表同一時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組存在顯著性差異（P<0.05）。Fig. 2.1 The effects ofAFB1 on the transcription level of 4 genes related to nutrition in themidguts of L.vannamei（a）eif4ebp,（b）eif4e1a,（c）eif4e2,（d）p70s6k；Bars with different letters above them aresignificantly different at P<0.05；* indicate significant differences between the controlgroup and the experimental group at each time point（P<0.05）.Dorsal 及 Relish 兩種免疫相關(guān)基因在投喂 AFB1 后的對(duì)蝦腸道中均呈現(xiàn)顯著的上調(diào)。Dorsal 基因從第 2 d 起呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，并于第 4 d 相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高，第 12d 降至初始水平（P<0.05）（圖 2.2-a）。Relish 基因自第 2d 起被顯著誘導(dǎo)并達(dá)到最高，此后上調(diào)程度逐漸降低，有回落的趨勢(shì)，于第

圖 2.2 飼料中添加 AFB1 對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道四種免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響（a）Dorsal,（b）Relish,（c）proPO,（d）mucin-like PM；不同字母代表在不同時(shí)間點(diǎn)之間基因存在顯著性差異，*代表同一時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組存在顯著性差異（P<0.05）。Fig. 2.2 The effects ofAFB1 on the transcription level of 4 genes related to immunology in themidguts of L.vannamei（a）Dorsal,（b）Relish,（c）proPO,（d）mucin-like PM；Bars with different letters abovethem are significantly different at P<0.05；* indicate significant differences between thecontrol group and the experimental group at each time point（P<0.05）.2.3.3 凡納濱對(duì)蝦腸道組織形態(tài)學(xué)分析對(duì)照組腸道上皮細(xì)胞排列緊密，與基膜緊密相連，細(xì)胞核邊緣清晰，內(nèi)壁向腸腔內(nèi)凸起形成褶皺（圖 2.3-1,2）。實(shí)驗(yàn)組第 2 d 腸道組織形態(tài)并未發(fā)生明顯變化，上皮細(xì)胞層完整，并未與基膜分離，細(xì)胞間隙較為清晰（圖 2.3-

圖 2.3 凡納濱對(duì)蝦腸道組織切片F(xiàn)ig. 2.3 Histological examination of L.vannamei midguts注：1,2 代表對(duì)照組腸道組織樣品；3,4,5,6 分別代表第 2,4,8,12 d 腸道組織樣品。其中 IEC代表腸道上皮細(xì)胞層，BM 代表基膜，CM 代表環(huán)肌層。Notes：Histological examination of 1,2 indicates the midgut of shrimp in control group; 3,4,5,6indicates the damage in midgut of shrimps fed withAFB1 containing diet at 2,4,8,12drespectively. Letters indicate different structures: IEC represents intestinal epithelial cells,BM represents basement membrane, CM represents circular muscle.2.4 討論對(duì)蝦腸道疾病嚴(yán)重制約著對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，而飼料質(zhì)量是影響對(duì)蝦腸道健康的重要因素之一，因此研究 AFB1 對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道黏膜屏障的影響有著重要的意義。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2750022