【摘要】：羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)是我國主要的養(yǎng)殖品種之一,目前養(yǎng)殖模式單一,養(yǎng)殖中后期常面臨氨氮濃度升高、水質(zhì)惡化等問題,而且富含氨氮的養(yǎng)殖尾水排放會導(dǎo)致周圍水體、土壤環(huán)境遭受污染。基于上述考慮,本文研究了氨氮對羅氏沼蝦的急性和慢性毒性作用,首次采用代謝組學(xué)方法分析了羅氏沼蝦對氨氮的代謝、解毒機(jī)制,通過圍隔實(shí)驗(yàn)研究了不同羅氏沼蝦養(yǎng)殖模式的環(huán)境效應(yīng)。1、氨氮短期脅迫對羅氏沼蝦抗氧化酶、熱休克蛋白和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響采用生物毒性實(shí)驗(yàn)方法研究了氨氮對體重為3.46±0.66 g羅氏沼蝦的急性毒性作用。設(shè)置非離子氨濃度0、0.5、1.88 mg·L~(-1),研究了氨氮脅迫4 h、8 h、12 h、24 h、48 h和72 h對羅氏沼蝦血淋巴、肌肉、鰓超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量,以及肌肉谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性的影響,并檢測了氨氮對其肌肉和肝胰腺抗氧化酶基因(SOD、CAT和GPX)、熱休克蛋白基因(HSP60、HSP70和HSP90)、細(xì)胞凋亡基因(Caspase 2、Caspase 3和Bcl-2)表達(dá)的影響。結(jié)果表明:(1)非離子氨對羅氏沼蝦24 h、48 h、72 h和96 h的半致死濃度(LC50)分別為7.72、5.44、4.28和3.78 mg·L~(-1),其安全濃度為0.378 mg·L~(-1)。(2)1.88 mg·L~(-1)組在8 h時顯著誘導(dǎo)了鰓T-SOD活性,72 h時顯著誘導(dǎo)了鰓CAT活性;0.5、1.88 mg·L~(-1)組24 h時顯著誘導(dǎo)了血淋巴CAT活性,1.88 mg·L~(-1)組24 h時亦同時顯著誘導(dǎo)了血淋巴T-SOD活性;72 h時,0.5、1.88 mg·L~(-1)組顯著誘導(dǎo)了肌肉GSH-Px活性。72 h時,1.88 mg·L~(-1)組羅氏沼蝦血淋巴、肌肉和鰓MDA含量均顯著高于對照組和0.5 mg·L~(-1)組。(3)1.88 mg·L~(-1)組肌肉SOD基因表達(dá)分別在8 h和24 h時被顯著誘導(dǎo),該組肝胰腺SOD基因也在8 h和48 h時被顯著誘導(dǎo);1.88 mg·L~(-1)組肌肉和肝胰腺CAT基因分別在3 h和8 h時被顯著誘導(dǎo)到最高值;1.88 mg·L~(-1)組肌肉和肝胰腺GPX基因均在8 h時被顯著誘導(dǎo)到最高值,其中肝胰腺GPX基因表達(dá)分別是對照組和低濃度組的23.86倍和12.21倍。(4)0.5 mg·L~(-1)組在3 h時顯著誘導(dǎo)了肌肉HSP60基因表達(dá),1.88 mg·L~(-1)組在8 h、24 h和72 h時均顯著誘導(dǎo)了肌肉和肝胰腺HSP60基因表達(dá);1.88 mg·L~(-1)組在8 h、24 h和48 h時顯著誘導(dǎo)了肝胰腺HSP70基因表達(dá),該濃度下肌肉HSP70基因表達(dá)僅在8 h時被誘導(dǎo),0.5 mg·L~(-1)組肝胰腺HSP70基因表達(dá)在8 h時被誘導(dǎo);1.88 mg·L~(-1)組分別在8 h、12 h和24 h時顯著誘導(dǎo)了肌肉HSP90基因表達(dá),在3h和72 h時誘導(dǎo)了肝胰腺HSP90基因表達(dá),0.5 mg·L~(-1)組在12 h時誘導(dǎo)了肌肉HSP90基因表達(dá),在72 h時顯著誘導(dǎo)肝胰腺HSP90基因表達(dá)。(5)1.88 mg·L~(-1)組肌肉和肝胰腺Caspase 2基因表達(dá)分別在3 h和8 h時被顯著誘導(dǎo)至最大值;1.88 mg·L~(-1)組肌肉Caspase 3基因表達(dá)在24 h和48 h時被顯著誘導(dǎo),肝胰腺Caspase 3基因表達(dá)在8h和24 h時亦被顯著誘導(dǎo);氨氮對肝胰腺Bcl-2基因表達(dá)無顯著影響,0.5 mg·L~(-1)組肌肉Bcl-2基因表達(dá)在3 h時被顯著誘導(dǎo)。氨氮脅迫72 h后,1.88 mg·L~(-1)組羅氏沼蝦肝胰腺出現(xiàn)明顯細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。2、氨氮短期脅迫與恢復(fù)對羅氏沼蝦抗氧化酶、熱休克蛋白和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響在溫度(25±1)℃、pH 8.0±0.5條件下采用生物毒性實(shí)驗(yàn)方法研究了氨氮對羅氏沼蝦幼蝦(0.16±0.06 g)的LC50。設(shè)置0、0.43、0.64、0.85、1.06 mg·L~(-1)等5個非離子氨濃度,研究了氨氮脅迫48 h及恢復(fù)48 h對羅氏沼蝦SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量的影響,并檢測了脅迫和恢復(fù)對其肌肉抗氧化酶基因(SOD、CAT和GPX)、熱休克蛋白基因(HSP60、HSP70和HSP90)、細(xì)胞凋亡基因(Caspase2、Caspase 3和Bcl-2)表達(dá)的影響。(1)非離子氨對羅氏沼蝦24 h、48 h、72 h、96 h的LC50分別為4.25、2.35、1.86、1.54 mg·L~(-1),安全濃度為0.154 mg·L~(-1)。(2)氨氮脅迫48 h時,各試驗(yàn)組羅氏沼蝦SOD活性顯著升高(P0.05),而CAT和GSH-Px活性變化不顯著(P0.05);與對照組相比,0.43、0.64和1.06 mg·L~(-1)組MDA含量顯著升高(P0.05)。與脅迫48h時相比,恢復(fù)48 h后各組SOD活性均顯著下降(P0.05);除0.85 mg·L~(-1)組外,其余試驗(yàn)組SOD活性仍然顯著高于對照(P0.05);0.85、1.06 mg·L~(-1)組CAT活性較脅迫狀態(tài)顯著下降(P0.05);試驗(yàn)組與對照組MDA含量無顯著差異。(3)氨氮脅迫48 h時,1.06 mg·L~(-1)組CAT基因表達(dá)顯著高于其余各組(P0.05),恢復(fù)48 h后各濃度組間無顯著差異。氨氮脅迫48 h對SOD基因表達(dá)無顯著影響,恢復(fù)48 h后0.43、1.06 mg·L~(-1)組SOD基因表達(dá)顯著高于其他組。氨氮脅迫48 h時,0.85 mg·L~(-1)組GPX基因表達(dá)顯著大于對照組(P0.05),恢復(fù)48h后GPX基因表達(dá)與對照組相比無顯著差異(P0.05)。(4)氨氮脅迫和恢復(fù)對HSP70基因表達(dá)均無顯著影響。脅迫48 h時,各試驗(yàn)組HSP90表達(dá)均顯著上升,恢復(fù)48 h后各組HSP90基因表達(dá)較脅迫時下降,且顯著低于對照組(P0.05)。脅迫48h時,除0.43 mg·L~(-1)組外的其余試驗(yàn)組HSP60基因表達(dá)顯著上升,恢復(fù)48h后表達(dá)量下降至與對照組無顯著差異。(5)氨氮脅迫48 h時,各試驗(yàn)組Caspase2、Caspase3表達(dá)皆顯著高于對照組;恢復(fù)48 h后,除0.43 mg·L~(-1)組外其余試驗(yàn)組Caspase2基因表達(dá)與對照組相比無顯著差異,各試驗(yàn)組Caspase3基因表達(dá)與對照組相比差異均不顯著。3、氨氮長期脅迫對羅氏沼蝦生長、代謝酶、抗氧化酶、代謝組的影響將羅氏沼蝦(0.28±0.05 g)暴露于非離子氨濃度為0、0.108、0.216、0.324和0.54 mg·L~(-1)中20d,研究氨氮對羅氏沼蝦生長、成活率、代謝酶活性的影響,同時檢測了0.108、0.324和0.54 mg·L~(-1)氨氮對其肌肉代謝組的影響。結(jié)果表明:(1)0.54 mg·L~(-1)組羅氏沼蝦成活率顯著降低,該組增重率也降低但差異不顯著。(2)0.216、0.324和0.54 mg·L~(-1)組羅氏沼蝦肝胰腺酸性磷酸酶(ACP)、谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸脫氫酶(GDH)活性顯著降低,0.216 mg·L~(-1)組的堿性磷酸酶(AKP)活性也顯著降低。隨氨氮濃度升高,肝胰腺和肌肉谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活性逐漸升高但差異不顯著,對谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活性的影響也同樣不顯著。0.216mg·L~(-1)組羅氏沼蝦肝胰腺尿素氮含量顯著高于對照組和0.54 mg·L~(-1)濃度組。(3)氨氮對肌肉CAT活性無顯著影響;0.324 mg·L~(-1)組SOD活性最大,顯著大于對照組和0.108 mg·L~(-1)組;0.216 mg·L~(-1)組MDA含量最低,顯著低于0.108mg·L~(-1)組,其余各組差異不顯著。(4)氨氮對羅氏沼蝦肌肉嘌呤代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝途徑、а-亞麻酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、谷胱甘肽代謝和膦酸鹽與磷酸酯代謝、萜類生物合成、賴氨酸降解以及賴氨酸生物合成途徑具有明顯的影響。上述研究可見,高濃度氨氮對羅氏沼蝦產(chǎn)生了脅迫效應(yīng),顯著影響其成活和生長。為探尋減少羅氏沼蝦養(yǎng)殖過程中氨氮積累的方法,本文采用圍隔實(shí)驗(yàn)研究了羅氏沼蝦不同養(yǎng)殖模式的環(huán)境效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置6種養(yǎng)殖模式:羅氏沼蝦單養(yǎng)(MP組)、羅氏沼蝦+浮萍(Lemna minor)(PP組)、羅氏沼蝦+鰱魚(Hypophthalmichthys molitrix)(PF組)、羅氏沼蝦+背角無齒蚌(Anodonta woodiana)+鰱魚(PMF組)、羅氏沼蝦+背角無齒蚌+浮萍(PMP組)、羅氏沼蝦+背角無齒蚌+浮萍+鰱魚(PMPF組),養(yǎng)殖64 d。評估了不同養(yǎng)殖模式對羅氏沼蝦生長、水質(zhì)以及腸道菌群的影響。4、養(yǎng)殖模式對羅氏沼蝦生長和水質(zhì)指標(biāo)的影響?zhàn)B殖過程中,每10 d測定一次水質(zhì)理化指標(biāo)(濁度、DO、pH、Chl-a、COD、BOD、NO_3-N、NO_2-N、NH_3-N、TN、TP、PO_4-P、TOC)。養(yǎng)殖結(jié)束(64 d)時測定增重率和成活率。結(jié)果表明,PMPF組增重率最大,但與其它組無顯著差異,各組間成活率也無顯著差異。PMPF組中平均DO最高,而PF組中TN和Chl-a濃度最高。與MP組相比,混養(yǎng)鰱魚的PF、PMF和PMPF組有效降低了PO_4-P含量。浮萍可有效吸收水中的N和P,有浮萍的PP和PMP組中Chl-a濃度較PF組顯著下降。PMPF養(yǎng)殖模式具有較好的生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益。5、不同養(yǎng)殖模式羅氏沼蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)及與水環(huán)境因子的關(guān)系通過高通量測序技術(shù)分析養(yǎng)殖模式對羅氏沼蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響,冗余分析(RDA)腸道菌群與水環(huán)境因子的關(guān)系。結(jié)果表明:腸道細(xì)菌多樣性指數(shù)MP組最大(4.08),PMF組(1.27)最低。變形菌門(Proteobacteria)、軟壁菌門(Tenericute)、厚壁菌門(Firmicutes)在蝦腸道中相對豐度較大。不同模式最大優(yōu)勢菌存在較大差異,其中MP、PMP和PMPF組為氣單胞菌屬(Aeromonas),PP組為檸檬酸桿菌屬(Citrobacter),PF和PMF組為Candidatus Hepatoplasma。腸道細(xì)菌與環(huán)境因子相關(guān)分析表明:TP對羅氏沼蝦腸道菌群具有顯著影響(P0.05)。腸棕氣單胞菌(Aeromonas enteropelogenes)、有益菌腸球菌(Enterococcus)、格氏乳酸菌(Lactococcus garvieae)與NO_3-N、TN正相關(guān),紅細(xì)菌屬(Rhodobacter)、假單胞菌(Pseudomonas vranovensis)與TP正相關(guān)�？梢�,養(yǎng)殖模式可通過影響水體營養(yǎng)鹽尤其是氮磷含量影響羅氏沼蝦腸道微生物群落結(jié)構(gòu)。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S917.4
【圖文】：

上海海洋大學(xué)博士學(xué)位論文2.2.7 氨氮對羅氏沼蝦肝胰腺細(xì)胞凋亡的影響氨氮對羅氏沼蝦肝胰腺細(xì)胞凋亡影響如圖 2-7 所示。圖中凋亡細(xì)胞被染成色，正常細(xì)胞為藍(lán)紫色。對照組未見有凋亡細(xì)胞（圖 2-7A），低濃度組（0.05mg·L-1）肝胰腺組織有少量細(xì)胞發(fā)生凋亡（圖 2-7B），而高濃度組（1.88 mg·L肝胰腺組織有較多細(xì)胞發(fā)生凋亡（圖 2-7C）。

圖4-6 QC樣本TIC重疊圖Fig. 4-6 The overlay chart of TIC spectra of QC sample4.2.5.2 QC樣本主成分分析質(zhì)控樣本QC可以相對聚集在一起，聚集得越好表明儀器越穩(wěn)定，采集的數(shù)據(jù)質(zhì)量越好。X軸表示第一個主成分，Y軸表示第二個主成分。括號里的數(shù)字表示該主成分能綜合原始信息的比例。由圖4-7可知，本實(shí)驗(yàn)質(zhì)控樣本QC較好聚集在一起，說明該分析過程具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

圖4-6 QC樣本TIC重疊圖Fig. 4-6 The overlay chart of TIC spectra of QC sample4.2.5.2 QC樣本主成分分析質(zhì)控樣本QC可以相對聚集在一起，聚集得越好表明儀器越穩(wěn)定，采集的質(zhì)量越好。X軸表示第一個主成分，Y軸表示第二個主成分。括號里的數(shù)字表該主成分能綜合原始信息的比例。由圖4-7可知，本實(shí)驗(yàn)質(zhì)控樣本QC較好聚集一起，說明該分析過程具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2747301