【摘要】：羅非魚(yú)是我國(guó)淡水魚(yú)類優(yōu)勢(shì)養(yǎng)殖品種。但在養(yǎng)殖過(guò)程中,鏈球菌病頻發(fā)嚴(yán)重制約了我國(guó)羅非魚(yú)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。目前對(duì)該病尚未有效防治方法,所以從種質(zhì)上入手,進(jìn)行抗鏈球菌病的定向選育,培育抗鏈球菌病羅非魚(yú)新品種(系),是值得期待的措施。本研究擬從克隆獲得尼羅羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)免疫相關(guān)基因補(bǔ)體C9(OnC9)和穿孔素基因(OnPFP)入手,對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)和組織表達(dá)分析,初步了解其生物學(xué)功能,并分析其單核苷酸多態(tài)性,進(jìn)行不同基因型或單倍型與尼羅羅非魚(yú)鏈球菌病抗性的關(guān)聯(lián)分析,以期篩選出有育種指導(dǎo)價(jià)值的優(yōu)勢(shì)基因型。取得的結(jié)果如下:1尼羅羅非魚(yú)OnC9和OnPFP的克隆和表達(dá)分析以尼羅羅非魚(yú)OnC9和OnPFP的預(yù)測(cè)序列為模板設(shè)計(jì)引物,獲得基因的中間片段序列。采用RACE方法獲得了OnC9和OnPFP的cDNA序列全長(zhǎng)。完整OnC9 cDNA序列長(zhǎng)度為2502bp,ORF為1761bp,編碼586個(gè)氨基酸。分析發(fā)現(xiàn)OnC9氨基酸存在保守結(jié)構(gòu)域:TSP1、LDLRA、MACPF、EGF-Lik。氨基酸序列同源性分析表明,OnC9與牙鲆C9氨基酸同源性最高,達(dá)73.0%,與其他魚(yú)類C9的同源性介于49.3-71.4%之間。本文的研究表明OnPFP存在兩個(gè)完整cDNA:OnPFP1和OnPFP2。OnPFP1完整cDNA序列長(zhǎng)度為2461bp,ORF為1764bp,編碼587個(gè)氨基酸。分析發(fā)現(xiàn)OnPFP1氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域?yàn)镸ACPF和C2。OnPFP2完整cDNA序列長(zhǎng)度為2442bp,ORF為1266bp,編碼421個(gè)氨基酸。OnPFP2僅存在C2結(jié)構(gòu)域。NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示,OnPFP1和OnPFP2氨基酸序列同源性為78.5%,OnPFP1與其他魚(yú)類的氨基酸序列同源性為38.2-75.0%,OnPFP2與其他魚(yú)類的氨基酸序列同源性為36.5-78.2%。熒光定量PCR(q PCR)檢測(cè)結(jié)果表明,OnC9基因在所檢測(cè)組織器官中表達(dá)水平有明顯差異。在肝臟中表達(dá)量最高,其次是在腸道、后腎、鰓和皮膚,在肌肉中表達(dá)量比較低,在腦、脾臟、心臟、頭腎和胸腺中表達(dá)量最低。無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)感染尼羅羅非魚(yú)168h內(nèi),肝臟、腸道、后腎、皮膚、肌肉、鰓中的OnC9表達(dá)量均表現(xiàn)為在感染后12h、48h(或36h)、120h先后出現(xiàn)三個(gè)峰值的波動(dòng)式表達(dá)的規(guī)律。OnPFP1和OnPFP2在腦、后腎、脾臟、心臟、肝臟、鰓、肌肉、頭腎、皮膚、胸腺、腸道、血液中均有表達(dá),它們?cè)诓煌M織中表達(dá)量不同,OnPFP1在脾臟和鰓中表達(dá)量較高,OnPFP2在脾臟和頭腎中表達(dá)量較高。無(wú)乳鏈球菌感染尼羅羅非魚(yú)216h內(nèi),OnPFP1在肝臟、脾臟、鰓、后腎、頭腎、胸腺中表達(dá)量均表現(xiàn)為先上升,再下降,然后再上升再下降的趨勢(shì)。OnPFP2在肝臟、脾臟、鰓、后腎中表達(dá)量逐漸上升,在胸腺中的表達(dá)量先上升后下降。2尼羅羅非魚(yú)補(bǔ)體C9和穿孔素基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)位點(diǎn)的篩選及其與鏈球菌病抗性的關(guān)聯(lián)分析首先克隆得到OnC9和OnPFP基因組序列,對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性分析,獲得了SNP位點(diǎn)。然后采用人工感染無(wú)乳鏈球菌的方法,建立尼羅羅非魚(yú)易感群體(81尾)和抗病群體(84尾),通過(guò)Snapshot法獲得SNP位點(diǎn),并研究這些多態(tài)性位點(diǎn)與鏈球菌病抗性之間的的相關(guān)性。通過(guò)PCR得到OnC9和OnPFP基因組DNA全長(zhǎng),獲得OnC9基因組DNA全長(zhǎng)6883bp,包含11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子。OnPFP1基因組DNA全長(zhǎng)6849bp,包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子,OnPFP2基因組DNA全長(zhǎng)3812bp,包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。在OnC9基因中獲得了22個(gè)潛在的SNPs位點(diǎn),其中19個(gè)在內(nèi)含子中,3個(gè)在外顯子中,2個(gè)非同義突變,1個(gè)同義突變。對(duì)22個(gè)位點(diǎn)在易感群體和抗病群體中進(jìn)行了基因型頻率和等位基因頻率檢測(cè),其中發(fā)現(xiàn)C-2660T和T-5790A位點(diǎn)的基因型分布頻率在抗病和易感群體中存在顯著性差異(P0.05)。連鎖不平衡分析表明,多個(gè)位點(diǎn)之間處于高度連鎖狀態(tài)(r20.80)。單倍型分析顯示,共發(fā)現(xiàn)了12個(gè)單倍型,其中單倍型GTTAG和ATGA與鏈球菌病易感性顯著相關(guān)(P0.05)。在OnPFP1基因中獲得16個(gè)潛在的SNPs位點(diǎn),其中13個(gè)在內(nèi)含子中,3個(gè)在外顯子中,1個(gè)在3’側(cè)翼區(qū),2個(gè)在外顯子中,均為非同義突變。對(duì)16個(gè)位點(diǎn)在易感群體和抗病群體中進(jìn)行了基因型頻率和等位基因頻率檢測(cè),其中發(fā)現(xiàn)T-499G和A-2684G位點(diǎn)基因型分布頻率在抗病和易感群體中存在顯著性差異(P0.05)。連鎖不平衡分析表明,G-2019C和A-3827C、A2154G處于高度連鎖狀態(tài)(r2=0.813,r2=0.955)。單倍型分析顯示,共發(fā)現(xiàn)了3個(gè)單倍型,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與鏈球菌病顯著相關(guān)的單倍型。在OnPFP2基因中獲得5個(gè)潛在的SNPs位點(diǎn),2個(gè)在內(nèi)含子中,1個(gè)在3’側(cè)翼區(qū),2個(gè)在外顯子中,均為非同義突變。對(duì)5個(gè)位點(diǎn)在易感群體和抗病群體中進(jìn)行了基因型頻率和等位基因頻率檢測(cè),沒(méi)有發(fā)現(xiàn)在抗病和易感群體中存在顯著性差異的位點(diǎn)。連鎖不平衡分析表明,其中C-690T與C-618T處于高度連鎖狀態(tài)(r2=0.83)。單倍型分析顯示,共發(fā)現(xiàn)了3個(gè)單倍型,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與鏈球菌病顯著相關(guān)的單倍型。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S943
【圖文】：

存在一個(gè) TSP1 結(jié)構(gòu)域，魚(yú)類和兩棲類的補(bǔ)體 C9 氨基酸序列在 C 端和 N 端各存在一個(gè) TSP1 結(jié)構(gòu)域 ，哺乳動(dòng)物 C 端不存在 TSP1 結(jié)構(gòu)域(圖 1-3)。家兔 Oryctolagus cuniculus (NP_001075815)人 Homo sapiens (NP_001728)牛 Bos Taurus (NP_001030441)小鼠 Mus musculus (NP_038513)爪蟾 Xenopus laevis (NP_001079814)草魚(yú) Ctenopharyngodon idella (ABN49522)香魚(yú) Plecoglossus altivelis (CBX31962)虹鱒 Oncorhynchus mykiss (CAJ01692)底溕 Fundulus heteroclitus (AAR87007)尼羅羅非魚(yú) Oreochromis niloticus紅鰭東方渶 Fugu rubripes (AAC60288)牙鲆 Paralichthys olivaceus (BAA86878)999110010099859899780.05圖 1-2 尼羅羅非魚(yú) C9 基因和其它動(dòng)物的 NJ 分子進(jìn)化樹(shù)Fig. 1-2 NJ-phylogenetic tree of C9 genes constructed by using amino acid sequences

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文2.3 OnC9 基因在健康尼羅羅非魚(yú)不同組織中的表達(dá)分析qPCR 檢測(cè)結(jié)果表明，OnC9 基因在所檢測(cè)的 12 個(gè)組織器官(腦、后腎、脾臟、心臟、肝臟、鰓、肌肉、頭腎、皮膚、胸腺、腸道、血液)中表達(dá)水平有明顯差異。OnC9 在肝臟中表達(dá)量最高，其次是腸道、后腎、鰓、皮膚，在肌肉中表達(dá)量比較低，腦、脾臟、心臟、頭腎和胸腺中表達(dá)量最低(圖 1-4)。

圖 1-5 無(wú)乳鏈球菌感染后尼羅羅非魚(yú)補(bǔ)體 C9 基因在尼羅羅非魚(yú)中各組織的表達(dá)情況注：相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示顯著性差異(P<0.05)Fig . 1-5 Quantitative expression profile of Oreochromis niloticus C9 gene after the challenge withStreptococcus agalactiaeNote: Same letters indicate no significant differences (P > 0.05), Statistical significance isrepresented by different letters (P< 0.05)3 討論研究表明，MAC 和穿孔素(MACPF)超家族是具有成孔功能的家族之一。其中，補(bǔ)體 C6、C7、C8、C9 因其在殺傷途徑中的重要作用，被統(tǒng)稱為末端補(bǔ)體成分(Terminal complement components，TCCs)。TCCs 中的補(bǔ)體 C6，C7，C8α，C8β和C9 是一組大小和復(fù)雜程度不同的結(jié)構(gòu)相關(guān)血漿蛋白，序列具有高度的相似性，屬于同一基因家族。TCCs 和穿孔素一樣，存在一些相同的保守結(jié)構(gòu)域，如 TSP1、LDLRA、MACPF 和 EGF-Like[11, 42, 43]。本研究采用 RACE 技術(shù)首次克隆了尼羅羅非魚(yú)補(bǔ)體 C9 基因(OnC9)的全長(zhǎng) cDNA 序列，共 2492bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?1761bp，編碼 586 個(gè)氨基酸。其中，OnC9 預(yù)測(cè)序列長(zhǎng) 2372bp，5’UTR 長(zhǎng) 34bp，3’UTR 長(zhǎng)577bp。本研究克隆得到的 5’UTR 和 3’UTR 序列比預(yù)測(cè)序列更長(zhǎng)更完整。相似性

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2 齊紅莉;沈偉良;喬秀亭;楊廣;;飼料磷和維生素D_3含量對(duì)尼羅羅非魚(yú)磷收支的影響[J];天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2010年02期

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本文編號(hào)：2744434