【摘要】：通過分子生物學(xué)方法對鰻鱺常見病原菌嗜水氣單胞菌OMP進行克隆與表達,制備基因工程疫苗,研究其對鰻鱺的免疫保護作用,同時通過重組表達的OMP從鰻鱺噬菌體抗體庫中篩選出特異性單鏈抗體,獲得其編碼基因序列,實現(xiàn)在大腸桿菌和酵母菌中的高效表達,并對其表達產(chǎn)物的生物學(xué)活性進行檢測與分析。以上研究將為養(yǎng)殖鰻鱺病害的免疫學(xué)防治奠定分子基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:(1)以實驗室保存的嗜水氣單胞菌(B11)外膜蛋白基因質(zhì)粒為模板,通過克隆、連接、測序后得到重組表達載體pGEX-4T-2-OMP,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后經(jīng)1 mM的IPTG誘導(dǎo)獲得分子量約為45 KD的目的蛋白。重組OMP經(jīng)純化、凍干、PBS溶解后注射免疫歐洲鰻鱺,同時設(shè)有嗜水氣單胞菌滅活組和PBS對照組。通過檢測14 d、21 d、28 d和42d歐洲鰻鱺不同組織溶菌酶活性、血清抗體水平、以及淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平對機體免疫水平進行評價,同時在28 d進行多種鰻鱺致病菌的攻毒試驗,對重組OMP免疫保護作用進行研究。結(jié)果表明:OMP免疫組和嗜水氣單胞菌滅活組均能引起魚類的非特異性免疫應(yīng)答反應(yīng),溶菌酶含量在21 d或28 d達到高峰;OMP組全血細(xì)胞的轉(zhuǎn)化水平在21 d時達到峰值,刺激指數(shù)顯著高于對照組和嗜水氣單胞菌滅活組(P0.05);OMP組與嗜水氣單胞菌滅活組的抗體效價均在28 d達到高峰,且顯著高于PBS對照組(P0.05);攻毒試驗結(jié)果表明重組OMP和嗜水氣單胞菌滅活菌苗對5種不同的嗜水氣單胞菌菌株均有不同程度的免疫保護作用,保護率均高于PBS對照組。(2)將重組OMP作為抗原對噬菌體抗體庫T7-Scfv進行淘洗,得到的10株抗體噬菌斑,ELISA阻斷實驗結(jié)果表明其抗體活性分別為68.2%、71.7%、77.7%、77.5%、81.7%、78.4%、77.7%、72.6%、72.8%、68.4%。提取噬菌斑基因組,分別對其編碼基因進行PCR和測序分析,選擇抗體活性最高的單鏈抗體基因,命名為OMP-Scfv。(3)以O(shè)MP-Scfv基因序列為模板,構(gòu)建pGEX-4T-2-Scfv原核表達載體和酵母pPIC9K-Scfv真核表達的載體,轉(zhuǎn)化BL21和酵母菌GS115,分別用IPTG和甲醇作為誘導(dǎo)劑進行誘導(dǎo)表達。獲得大腸桿菌表達產(chǎn)物為約53 KD(其中目的蛋白約27 KD,GST標(biāo)簽約26 KD),酵母菌表達產(chǎn)物約為27 KD的目的蛋白。并對其表達產(chǎn)物的生物學(xué)活性進行檢測與分析。綜上所述,本實驗獲得的重組OMP具有較強的免疫原性,對多種不同嗜水氣單胞菌菌株均有良好的免疫保護作用;通過噬菌體抗體庫T7-Scfv篩選到抗重組OMP的特異性單鏈抗體,并實現(xiàn)了在大腸桿菌和酵母菌的表達,表達產(chǎn)物生物學(xué)活性進行檢測后,為其在鰻鱺細(xì)菌性疾病防治中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：集美大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S943
【圖文】：

鱺嗜水氣單胞菌外膜蛋白的基因擴增：M 為 Marker，1 和 2 為目的基因長約 1200體使用試劑盒進行連接后，提取連=1.95，使用 BamHⅠ與 NotⅠ快切切，如圖 2-2。

-1 鰻鱺嗜水氣單胞菌外膜蛋白的基因擴增電泳注：M 為 Marker，1 和 2 為目的基因長約 1200 bp 載體使用試劑盒進行連接后，提取連接80=1.95，使用 BamHⅠ與 NotⅠ快切酶酶切，如圖 2-2。

【參考文獻】

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本文編號：2739451