發(fā)布時間：2020-06-30 22:03

【摘要】：中國大鯢(Chinese giant salamander, Andrias davidianus)俗稱娃娃魚,是現(xiàn)存最大的珍稀兩棲動物,具有極高的經(jīng)濟價值,其養(yǎng)殖在我國華中、西南及西北等地區(qū)發(fā)展迅速。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的迅速擴大,人為控溫與高密度等養(yǎng)殖方式改變或破壞了大鯢的自然生活習(xí)性,致使大鯢抗病能力下降,各種疾病時有發(fā)生,給大鯢養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的影響。大鯢蛙病毒(Chinese giant salamander ranavirus, CGSRV)就是近些年來發(fā)現(xiàn)的一種嚴(yán)重危害大鯢健康的新病原,其屬于虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒屬(Ranavirus)成員。該病毒感染大鯢引起體表潰瘍,大量出血斑,頭部與四肢腫脹甚至潰爛等癥狀,具有傳播快、發(fā)病急、發(fā)病率與死亡率高等特點,故被廣大養(yǎng)殖戶稱之為“大鯢的癌癥”。為更好地保護大鯢養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè),減少經(jīng)濟損失,該病的早期、準(zhǔn)確診斷在其預(yù)警上起著重要的作用,本研究擬建立大鯢蛙病毒qPCR檢測技術(shù),為大鯢蛙病毒的早期診斷與流行病學(xué)調(diào)查提供重要的技術(shù)手段。本研究根據(jù)大鯢蛙病毒(CGSRV)的49L這個名為US22家族基因的ORF區(qū),設(shè)計了一對引物并進行PCR擴增,以獲得該基因序列,將其與pMD19-T進行連接,再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中,用于構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T-49 L。提取陽性質(zhì)粒,測定重組質(zhì)粒濃度,進行10倍梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品模板。設(shè)計特異性的引物和TaqMan MGB探針,進行TaqMan MG B熒光定量PCR擴增,優(yōu)化反應(yīng)程序,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,建立大鯢蛙病毒49LORF的TaqMan MGB熒光定量PCR檢測方法,同時對該檢測方法進行特異性、敏感性、重復(fù)性進行評估,并對疑似大鯢血液樣品進行檢測。結(jié)果顯示,該US22家族基因序列長639 bp,與NCBI-Blast與Genbank比對證實與目的序列一致。在確定了TaqMan MGB熒光定量PCR的最佳退火溫度為60℃后,繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.997,擴增效率為99.14%。該方法對大鯢蛙病毒的檢測有高度特異性,與大鯢蛙病毒、云斑尖塘鱧病毒、淋巴囊腫病毒、鯉皰疹病毒Ⅲ型、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌、熒光假單胞菌和遲鈍愛德華氏菌之間均無交叉反應(yīng)。靈敏性良好,最低能檢測到2.00×1O1copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品濃度,比常規(guī)PCR高出3個數(shù)量級濃度梯度(常規(guī)PCR能檢測到2.00×104copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品濃度)。批內(nèi)和批間重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.5,變異系數(shù)均小于2%,表明該方法的重復(fù)性好；在73份疑似樣品的檢測中,TaqMan MGB qPCR能檢測到45份陽性樣品,檢出率61.64%,常規(guī)PCR檢出陽性32份,且均與TaqMan MGB熒光定量PCR檢出結(jié)果一致。TaqMan MGB qPCR較常規(guī)PCR的檢測符合率Po值為82.19%,Kappa值為0.6537,兩者一致性較好。但TaqMan MGB qPCR能夠檢測到更低濃度的陽性感染,較PCR的敏感性更佳。鑒于本研究建立的大鯢蛙病毒49L ORF的TaqMan MGB熒光定量PCR檢測方法具有快速、特異、敏感、可重復(fù)、可定量、可同時對大批量樣品進行檢測、可通過血液檢測的方式實現(xiàn)活體監(jiān)測等優(yōu)點,其在大鯢蛙病毒的早期潛伏感染的快速診斷具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S947.3
【圖文】：

即每擴增一條ＤＮＡ鏈，就有一個巧光分子形成，實現(xiàn)了巧光信號的累積與逡逑ＰＣＲ產(chǎn)物形成完全同步。本研巧為實現(xiàn)良好的特異性使用的是Ｔ叫Ｍａｎ邋ＭＧＢ探逡逑針（圖３邋），即在普通的ＴａｑＭａｎ探針基礎(chǔ)上加入了邋ＭＧＢ邋（Ｍｉｎｏｒ邋Ｇｒｏｏｖｅ邋Ｂｉｎｄｅｒ）逡逑修飾基團，其采用非巧光萍滅基團，自身不產(chǎn)生焚光，可使本底信號的強度大大逡逑降低。ＭＧＢ探針可Ｗ比普通ＴａｑＭａｎ探針設(shè)計得更短，可使得探針設(shè)計變得更逡逑為容易，大大提氋了設(shè)計的成功率，ＭＧＢ修飾基團可Ｗ更好地提氋探針的Ｔｍ逡逑值，保證探針可Ｗ具有更好的特異性，且對于富含Ａ／Ｔ的模板可＆區(qū)分得更為逡逑理想。逡逑１１逡逑

３N２邋４９Ｌ邋ＯＲＦ的ＰＣ民擴增結(jié)果逡逑用引物ＦＩ、Ｒ１對ＣＧＳＲＶ的４９Ｌ邋ＯＲＦ進行ＰＣＲ擴增，于凝膠成像系統(tǒng)中逡逑觀察擴增結(jié)果，見圖５。由圖可見，擴增條帶與目的基因的片段長度一致。逡逑（ｂｐ）邋ＭＮ＾逡逑２０００－四逡逑１０００—ｍｍｎｉ逡逑７Ｓｎ邋￣＾ＢＳＫＳＫＢａＢｒｎｍ逡逑５００邋—逡逑２５０－

本文編號：2735878