【摘要】：神經(jīng)壞死病毒(nervous necrosis virus,NNV)是多種海水養(yǎng)殖魚類的病原,容易感染稚魚和幼魚。其導(dǎo)致的病毒性神經(jīng)壞死病死亡率高,給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)該病的治療還沒有有效的藥物和疫苗,因此開發(fā)簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)的快速檢測(cè)NNV的方法非常重要。本文針對(duì)赤點(diǎn)石斑魚神經(jīng)壞死病毒,設(shè)計(jì)了特異性引物,建立了交叉引物等溫?cái)U(kuò)增體系,并對(duì)該方法的Mg2+濃度、d NTPs濃度、反應(yīng)溫度三個(gè)重要參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后的反應(yīng)體系為:5 mmol/L Mg Cl2、1.2 mol/L Betaine、1.2 mmol/L d NTPs、1.6μmol/L引物1a、0.8μmol/L引物2a/3a、0.2μmol/L引物4s/5a、10×Thermo Pol Buffer 2.5μL、Warmstart Bst DNA聚合酶8 U、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶28 U以及適量的RNA模板,DEPC水補(bǔ)足至25μL。優(yōu)化后的反應(yīng)參數(shù)為69oC保溫60 min,然后80oC保溫5 min終止反應(yīng),最后采用切向流試紙條通過肉眼判斷檢測(cè)結(jié)果。該方法的檢測(cè)極限為101copies/μL RNA模板,比常規(guī)RT-PCR高10倍,與熒光定量RT-PCR靈敏度相當(dāng)。該方法反應(yīng)特異性良好,與病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)、傳染性胰臟壞死病毒(IPNV)、大菱鲆紅體病虹彩病毒(TRBIV)、淋巴囊腫病毒(LCDV)、哈維氏弧菌(Vibrio.harveyi)、鰻弧菌(V.anguillarum)等多種魚類病原均無交叉反應(yīng)。使用該方法對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè),與LAMP試劑盒方法相比較,更容易分辨陰性和弱陽性。本實(shí)驗(yàn)所建立的赤點(diǎn)石斑魚神經(jīng)壞死病毒交叉引物等溫?cái)U(kuò)增聯(lián)合切向流試紙條方法(CPA-LFD)簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高且特異性強(qiáng),可以廣泛用于疾病的現(xiàn)場(chǎng)快速診斷。近年來,表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)用于基因的檢測(cè)越來越受到研究者們的關(guān)注。本研究還為快速檢測(cè)魚類神經(jīng)壞死病毒,設(shè)計(jì)了病毒特異性的發(fā)夾型探針,經(jīng)硫醇修飾后與納米銀溶膠結(jié)合,制備了魚類神經(jīng)壞死病毒納米探針(Ag-NNV),并使用透射電鏡、多功能酶標(biāo)儀、表面增強(qiáng)拉曼光譜儀等對(duì)納米探針Ag-NNV的表征及發(fā)夾型探針在納米銀粒子表面的覆蓋率進(jìn)行了測(cè)定和分析。結(jié)果表明,裸露的納米銀粒子為球形,平均直徑50 nm;制備的納米探針顆粒為球形,平均直徑90 nm。納米銀粒子和納米探針在溶液中均具有良好的分散性。平均每個(gè)納米銀粒子表面結(jié)合發(fā)夾型探針約100條,單位表面積的探針覆蓋量為0.56 pmol/cm2。該納米探針制備簡(jiǎn)便,適合用于表面增強(qiáng)拉曼散射法對(duì)魚類神經(jīng)壞死病毒進(jìn)行快速檢測(cè)。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S941.4
【圖文】：

圖 1-1 單交叉引物 CPA 反應(yīng)原理圖Figure 1-1 Single cros-priming CPA mechanism相對(duì)于固體培養(yǎng)法的檢測(cè)結(jié)果，CPA 的檢測(cè)靈敏度為 84.1%，特異性為 97.8%，

引物位置和引物序列

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 MU Yinnan;LIN Kebing;CHEN Xinhua;AO Jingqun;;Diagnosis of nervous necrosis virus in orange-spotted grouper,Epinephelus coioides, by a rapid and convenient RT-PCR method[J];Acta Oceanologica Sinica;2013年10期

本文編號(hào)：2732005