【摘要】：傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)是彈狀病毒科、諾拉彈狀病毒屬成員,可引起鮭科魚類稚魚和幼魚的造血器官出血和壞死。傳染性造血器官壞死病廣泛流行于北美、歐洲和亞洲各國(guó),已成為世界性鮭鱒魚病,給鮭鱒養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)損失,迄今為止,針對(duì)IHN尚無(wú)有效的治療方法,因此,深入探討IHNV的毒力及免疫原性為研究其致病機(jī)制和免疫機(jī)理提供科學(xué)而有力的依據(jù)。IHNV基因組為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA,大小約11 kb,編碼5種結(jié)構(gòu)蛋白和1種獨(dú)特的非結(jié)構(gòu)蛋白。分別為核衣殼蛋白N,磷酸化蛋白P,膜基質(zhì)蛋白M,囊膜糖蛋白G,非結(jié)構(gòu)蛋白NV和RNA聚合酶大蛋白L。其中G蛋白既是糖蛋白,又是病毒的毒力蛋白,含有病毒主要的抗原決定簇,刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,在病毒致病性和免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮重要作用。囊膜蛋白的糖基化是病毒在繁衍進(jìn)程中出現(xiàn)的一個(gè)普遍現(xiàn)象,糖基化位點(diǎn)的改變可以影響病毒蛋白的折疊及構(gòu)象,從而影響病毒的復(fù)制及在機(jī)體中的免疫原性。為了研究IHNV G蛋白的糖基化對(duì)病毒毒力及免疫原性的影響,本研究通過在線軟件預(yù)測(cè)出G蛋白4個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn),分別將wtIHNV HLJ-09株的G蛋白第56位、379位、401位和438位氨基酸的天冬酰胺N突變?yōu)楸彼酇,再三點(diǎn)聯(lián)合突變和四點(diǎn)聯(lián)合突變,通過酶切、測(cè)序等方法確證突變成功。通過反向遺傳技術(shù),拯救9株重組病毒,拯救出的病毒對(duì)CHSE-214細(xì)胞出現(xiàn)明顯的致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。通過RT-PCR鑒定、分子標(biāo)識(shí)的鑒定、電鏡觀察以及間接免疫熒光檢測(cè)等都檢測(cè)到了重組病毒;用G蛋白多克隆抗體通過Western Blot鑒定對(duì)重組病毒的糖基化進(jìn)行分析,證明了預(yù)測(cè)的4個(gè)位點(diǎn)是wtIHNV HLJ-09G蛋白的糖基化位點(diǎn),并且通過突變糖基化位點(diǎn)氨基酸達(dá)到去糖基化的目的。對(duì)重組病毒的生物學(xué)特性做了研究,一步生長(zhǎng)曲線顯示重組毒rIHNV-N56A-N401A-N438 A、rIHNV-N379A-N401A-N438A 和 rIHNV-N56A-N379A-N401A-N438A 在 CHSE-214 細(xì)胞上的復(fù)制能力明顯低于其它重組毒和親本毒,說(shuō)明同時(shí)突變G蛋白第401和438兩個(gè)氨基酸時(shí)會(huì)很大程度地降低病毒的復(fù)制能力。9株重組毒和親本毒對(duì)EPC、CHSE-214和RTG-2易感細(xì)胞的嗜性相同,都是在CHSE-214中復(fù)制最快,在RTG-2中復(fù)制最慢。在這三種細(xì)胞系上,9株重組病毒的滴度水平上呈同樣的趨勢(shì),可見不同重組病毒體外復(fù)制能力的差異是由病毒本身引起的,與細(xì)胞系種類無(wú)關(guān)。將鑒定正確的9株重組病毒對(duì)1g的虹鱒稚魚做了累積致死率的比較,結(jié)果顯示只有rIHNV-N438A組在30d內(nèi)的累積死亡率低于50%,表明單獨(dú)突變第438位氨基酸可降低病毒對(duì)虹鱒的致死率。通過對(duì)死亡虹鱒的組織病理觀察,看到9株重組毒都能使虹鱒的肝、腎、心等組織發(fā)生典型病變。用熒光定量PCR方法檢測(cè)被各重組毒攻毒后虹鱒肝腎組織的病毒拷貝數(shù),結(jié)果顯示同樣是IHNV-N56A-N401A-N438A、rIHNV-N379A-N401A-N438A 和 rIHNV-N56A-N379A-N401A-N438A 的拷貝數(shù)最低,表明當(dāng) G 蛋白第401和438兩個(gè)氨基酸聯(lián)合突變時(shí)也會(huì)降低病毒在體內(nèi)的復(fù)制能力。將各重組毒及親本毒分別免疫平均體重10g健康的虹鱒幼魚,在免疫后第14d、28d、42d和56d分別尾靜脈采集各組虹鱒血清,ELISA檢測(cè)血清中特異性IgM的效價(jià),結(jié)果表明重組病毒能誘導(dǎo)虹鱒機(jī)體產(chǎn)生特異性IgM,其中將G蛋白第438位氨基酸單獨(dú)突變后能使特異性抗體IgM提前產(chǎn)生,推測(cè)第438位氨基酸的糖基化可能和病毒的免疫逃逸現(xiàn)象有關(guān),也推斷出這與導(dǎo)致虹鱒致死率降低有關(guān)。對(duì)rIHNV-N438A組30d未死亡的虹鱒再次攻擊親本毒后,30d內(nèi)的累積死亡率為25%,可見經(jīng)重組毒免疫后的虹鱒對(duì)親本毒具有一定的抵抗能力。本研究證實(shí)了糖基對(duì)病毒的重要影響,為研究傳染性造血器官壞死病毒的致病機(jī)理和免疫機(jī)理提供依據(jù),同時(shí)為該病減毒活疫苗的研制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S941.41
【圖文】：

首先通過重疊延伸ＰＣＲ的方法將相應(yīng)的位點(diǎn)在Ｆ２和Ｒ段上進(jìn)行定點(diǎn)突變，然后，逡逑在中間載體ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ邋ＩＩ邋ＳＫ－Ｆ５４３２１６上將Ｆ２和Ｆ３段進(jìn)行替換，最后將整個(gè)ｃＤＮＡ雙酶逡逑切下來(lái)，插入到真核表達(dá)載體ｐＣＩ中。構(gòu)建策略如圖２－１，表２－２：逡逑１４逡逑

３．１邋Ｇ蛋白潛在糖基化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果逡逑根據(jù)在線軟件邋ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／邋ＮｅｔＮＧｌｙｃ邋ｓｅｒｖｅｒ邋，預(yù)測(cè)出邋Ｇ邋蛋白邋４邋個(gè)潛在逡逑的糖基化位點(diǎn)，分別是ａａ５６？５９、ａａ３７９？３８２、ａａ４００？４０４和ａａ４３８？４４１。預(yù)測(cè)結(jié)果如圖３－１逡逑Ｈａｍｃ：邐Ｓｅｑｕｅｎｃｅ邐Ｌｅｎｇｔｈ：邐５０８逡逑ＩＤＩＴＩＩＴＰＬＩＬＩＬＩＴＣＧｉＪｌＳＱｒｙＱＳＤＴＡＳＥＳＤＱＰＴ￥ＳＩｌＰＬＦＴＹＰＥＧＣＴＬＤＩＬＳＩ７ＨＡ．ＳＱＬＲＣＰＲＩＦＤＤＥＨＲＧＬＩＡＹ？ＴＳＩ邐８０逡逑ＲＳＬＳＶＣＲＤＬＧＤＩＨＴＱＧｉｍｎｉＴＬＹｌｌＩＩＣＳＴＧＦＦＧＧＱＩＩＥＩＶＬｙＥＭＫＬＳＩＲＥＡＧＡＴＤＴＴＴＡＡＡＬＹＦｒＡＰＲＣＱｒＴＴＤＦｙＱＨＤ邐１６０逡逑ＬＩＦＴＴＴＴＱＩＳＶＬＲＤＰＹＴＲＤＦＬＤＳＤＦＶＣＧＫＣＴＫＳＰＣＱＴｆｆｆＳｍＴＩＧＤＡＧＩＰＡＣＤＳＳＱＥＩＫＣＨＬＦＹＤＩＩＳＩＫｍＡＴＳＹＧｎ邐２４邋０逡逑ＨＰＩＧＬｎＲＡＣＩＩＥＦＣＫＧＱＴＩＲＴＤＬＣＤＬＩＳＹＶＴＨＳＧＳＹＴＬＳＦＰＩＣＥＤＫＴＹＧＩＫＧｉｒＬＤＤＦＡＴＬＤＥＬＶＩＡＳＥＳＲＥＥＣＬＥＡＪＩＡＥＩ邐３２０逡逑ＩＳＴＩＳＹＴＰＴＬＬＳＫＦＲＳＰＨＰＣＩＨＤＶＴＡＩＨＫＧＳＩＴＨＧＩＣＩＴＹＴＹＤＥＶＳＫＤＲＩＴＴＫＡｉｎｉＡＩｌ

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 李玲梅;王承健;韓健利;柳人丹;溫婭楠;魏明;晉萬(wàn)軍;黃琳娟;王仲孚;;β-伴大豆球蛋白的N-糖基化位點(diǎn)及其N-糖鏈的質(zhì)譜分析[J];高等學(xué)�；瘜W(xué)學(xué)報(bào);2018年03期

2 張琪;吳秀菊;俞婷;王志林;崔百元;朱慶鋒;貝錦龍;;重組畢赤酵母植酸酶N-糖基化位點(diǎn)質(zhì)譜鑒定[J];華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2018年05期

3 謝琴芳;趙曉東;張琴;黃路;毛華偉;趙耀;;人偏肺病毒融合蛋白N-糖基化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)及不同N-糖基化修飾突變體的構(gòu)建[J];實(shí)用兒科臨床雜志;2009年22期

4 陳新江;孟慶來(lái);毛潔;張曉燕;張耀洲;;馬傳染性貧血病毒膜蛋白基因的改造及其在真核細(xì)胞中的表達(dá)[J];浙江理工大學(xué)學(xué)報(bào);2008年05期

5 徐勝男;時(shí)建立;彭U

本文編號(hào)：2727468