【摘要】：近年來,隨著石斑魚養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展,我國的石斑魚養(yǎng)殖產(chǎn)量已經(jīng)接近10萬噸。隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大,各種細菌性、病毒性、寄生蟲等疾病頻發(fā),造成石斑魚大量死亡,給石斑魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。其中,哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)是引起石斑魚病害中最重要的病原之一。本文利用從患病的美洲黑石斑中分離鑒定得到的哈維氏弧菌CJG-1株,對其生長特性以及制備滅活疫苗的最佳條件進行探究,利用哈維氏弧菌感染美洲黑石斑,探討對美洲黑石斑(Centropristis striata)血清指標和組織中的相關(guān)免疫基因表達的影響,以及制備全菌滅活疫苗對美洲黑石斑進行免疫實驗,探究對免疫相關(guān)基因在不同組織中的免疫應(yīng)答影響,最后通過人工感染實驗檢測疫苗對美洲黑石斑的免疫保護效果,主要內(nèi)容如下:(1)對CJG-1哈維氏弧菌進行活化培養(yǎng),條件180 rpm、28℃進行培養(yǎng),定時檢測菌液濃度,得出哈維氏弧菌CJG-1株的對數(shù)增長期為4-12 h;利用活化培養(yǎng)12h的菌液制備全菌滅活疫苗,甲醛濃度設(shè)置梯度為0、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%,分別放置在4℃、28℃條件下,滅活24h,經(jīng)疫苗質(zhì)量和安全性檢測后,得到滅活疫苗最佳條件為甲醛濃度0.2%,28℃,滅活24h。(2)對美洲黑石斑腹腔注射0.2ml,1×10~8 cfu/ml的CJG-1哈維氏弧菌菌液,進行人工感染試驗,測定0h(感染前)、6h、12h、18h、24h、36h、48h、72h、96h血清中的溶菌酶、堿性磷酸酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶等生化指標,結(jié)果顯示4種酶活性均不同程度地升高且顯著高于對照組,說明美洲黑石斑在受到病菌感染時,機體抗感染的各項指標均增強來抵抗相關(guān)的損害因子對機體的傷害。(3)人工感染后,在0h(感染前)、6h、12h、18h、24h、36h、48h、72h、96h共9個時間點,靜脈取血后,快速解剖取脾臟、頭腎、肝臟、鰓4種組織于裝有RNA保存液的離心管中,用于后期RNA提取并反轉(zhuǎn)成cDNA,利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計TLR2、MyD88、HSP70的特異性引物,以β-action為內(nèi)參,采用RT-PCR技術(shù),檢測3種基因在4種組織中的相對表達量,結(jié)果顯示,TLR2和MyD88在脾臟和肝臟中上調(diào)倍數(shù)最顯著,分別為9.3和21倍以及9.9和5.9倍,頭腎中的MyD88在6h時迅速上調(diào)至峰值2.3倍,鰓中MyD88在36h時上調(diào)8.3倍;頭腎與鰓中的HSP70反應(yīng)迅速,在18h上調(diào)至最大倍數(shù)為11.2和10.7倍,肝臟和脾臟分別在72h時上調(diào)至最大倍數(shù)9.7和2.8倍,說明TLR2、MyD88、HSP70參與了哈維氏弧菌感染的免疫應(yīng)答,此外也說明,除了頭腎和脾臟,肝臟和鰓在免疫應(yīng)答過程中也是重要的檢測評價組織。(4)在甲醛濃度為0.2%,28℃條件下,對哈維氏弧菌CJG-1株滅活24h,制得全菌滅活疫苗,對美洲黑石斑腹腔注射0.2ml,1×10~9cfu/ml的疫苗,在0h(免疫前)、6h、12h、18h、24h、36h、48h、72h、96h共9個時間點,取組織脾臟、頭腎、肝臟、鰓保存在RNA保存液中用于后期熒光定量PCR檢測TLR2、MyD88、HSP70相對表達量。2周后同樣劑量和方式加強免疫一次,第4周進行用1×10~8cfu/ml的哈維氏弧菌菌懸液進行攻毒。結(jié)果顯示得出TLR2和MyD88在頭腎和肝臟中上調(diào)趨勢顯著,其中MyD88在36h出現(xiàn)峰值為73.2和95倍,肝臟中的TLR2在24h上調(diào)至最大62.倍,頭腎在36h峰值達到144.4倍,HSP70在脾臟、頭腎、肝臟、鰓中均在18-48h之內(nèi)表達量出現(xiàn)峰值,其中頭腎在48h上調(diào)為對照組的6.2倍,肝臟在18h時上調(diào)為對照組的6.6倍;攻毒試驗結(jié)果顯示免疫后的美洲黑石斑獲得了較強的免疫保護力,其相對保護率為85.71%,因此,從分子研究角度對免疫基因表達分析說明TLR2、MyD88、HSP70這3種基因參與到美洲黑石斑免疫應(yīng)答過程中,良好的免疫保護率也說明疫苗免疫刺激能提高機體的免疫力,本實驗制備的滅活疫苗對美洲黑石斑的免疫保護是有效。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S943
【圖文】：

32圖 5-1 美洲黑石斑感染哈維氏弧菌后脾臟（A）、頭腎（B）、肝臟（C）、鰓（D）中 TLR2 的相對表達量Fig.5-1 Expression of TLR2 in spleen(A), head kidney(B),liver(C) and gills(D) 0f Centropristisstriata infected by Vibrio harveyi*表示不同時間點的表達量與對照組之間有顯著性差異（P＜0.5），下同。Therewas asignificant differencebetween the expression at different time points and the controlgroup (P<0.05)，thesameas below.5.7.3 Myd88 在脾臟,頭腎，肝臟和鰓中的表達脾臟中的 Myd88 在受感染后 6h 迅速上調(diào)為對照組的 2 倍，在 36h 時上調(diào)達到最大為對照組的 9.3 倍（圖 5-2A）；在頭腎中也是在 6h時迅速上調(diào)至 2.3 倍，達到最大值，36h和 72h時顯著上調(diào)（P＜0.5），其他各時間點變化不顯著（圖 5-2B）；

除 48h和 96h差異不顯著外，其他各時間點平均上調(diào)為 2-3 倍（圖 5-2C）；（圖5-2D）中可以看出，24-48h內(nèi)顯著上調(diào)（P＜0.5），在 36h時達到最大，為對照組的 8.3 倍，其他各時間點變化不顯著。圖 5-2 美洲黑石斑感染哈維氏弧菌后脾臟（A）、頭腎（B）、肝臟（C）、鰓（D）中 Myd88的相對表達量Fig.5-2 Expression of MyD88 in spleen(A), head kidney(B),liver(C) and gills(D) 0fCentropristis striata infected by Vibrio harveyi5.7.4 HSP70 在頭腎，肝臟，脾臟和鰓中的表達從圖5-3A可以看出，HSP70在脾臟中的相對表達量及變化情況，受到感染后，6h表達量顯著升高（P＜0.5）

【參考文獻】

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本文編號：2727374