【摘要】：鯉春病毒血癥(Spring viremia of carp,SVC)是危害鯉科魚類的一種急性、高傳染性和高致死性的水產(chǎn)疾病,對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí),SVC也是必須要向世界動物衛(wèi)生組織申報(bào)的動物疫病之一。疫苗免疫是對其進(jìn)行防控的最有效措施。在水產(chǎn)動物免疫途徑中,注射方式效果最好,但不適合漁業(yè)生產(chǎn);浸浴免疫操作簡單,適合在魚苗和魚類大規(guī)模養(yǎng)殖中推廣使用。但是浸泡疫苗的應(yīng)用需要克服生物屏障等阻礙作用,才能使疫苗發(fā)揮出理想的免疫效果。納米載疫苗靶向遞呈技術(shù)的研究是解決水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)實(shí)現(xiàn)疫苗高效免疫保護(hù)最安全有效的手段之一。本研究通過化學(xué)修飾技術(shù)構(gòu)建靶向性碳納米管載疫苗系統(tǒng),經(jīng)浸浴和注射的方式免疫鯉后評價(jià)該疫苗系統(tǒng)對SVC的預(yù)防效果,并進(jìn)一步通過免疫熒光和活體成像技術(shù)研究該疫苗系統(tǒng)的免疫增效機(jī)制,最后從免疫濃度、免疫密度和浸浴免疫時(shí)間這幾方面進(jìn)行免疫方案優(yōu)化。取得的結(jié)果如下:1.靶向性碳納米管載疫苗系統(tǒng)的構(gòu)建采用發(fā)酵和純化技術(shù)制備重組SVCV糖蛋白(G),并經(jīng)過化學(xué)修飾技術(shù)分別對單壁碳納米管(SWCNTs)和甘露糖(Mannose)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,再通過化學(xué)連接技術(shù),構(gòu)建靶向性碳納米管載疫苗系統(tǒng)(SWCNTs-MG)。隨后,將疫苗系統(tǒng)與鯉巨噬細(xì)胞、鯉上皮細(xì)胞(EPC)和鯉進(jìn)行共孵育,通過細(xì)胞活力檢測和組織切片觀察等方法進(jìn)行疫苗系統(tǒng)的安全性評價(jià)。結(jié)果顯示:靶向性碳納米管載疫苗系統(tǒng)已構(gòu)建成功,其中抗原蛋白約占40.2%,甘露糖約占3.4%。在細(xì)胞水平,濃度小于40μg/mL的疫苗系統(tǒng)處理后,鯉巨噬細(xì)胞和EPC細(xì)胞的存活率均達(dá)到了80%以上;在個(gè)體水平,疫苗系統(tǒng)對鯉以60 mg/L的濃度進(jìn)行浸浴免疫24 h后,鯉的腦、鰓、腸、腎、肝和脾等組織器官均未出現(xiàn)損傷或異常,并且在免疫后60 d內(nèi),和對照組相比,免疫后的鯉沒有出現(xiàn)病變或異常。2.靶向性碳納米管載疫苗系統(tǒng)的免疫效果研究將靶向性碳納米管載疫苗系統(tǒng)分別通過浸浴和注射的方式免疫鯉(1.0±0.2 g),采用酶聯(lián)免疫吸附法、熒光定量PCR和病毒攻毒來評價(jià)該疫苗系統(tǒng)的免疫效果。結(jié)果顯示:無論是通過浸浴免疫還是注射免疫,和對照及其他同濃度/劑量的疫苗(G、MG和SWCNTs-G)相比,SWCNTs-MG可顯著提高免疫后鯉的血清抗體效價(jià)水平(P㩳0.01);增強(qiáng)補(bǔ)體C3、超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)活性(P㩳0.05)和免疫相關(guān)基因(TNF-α、IL-10、Cxcr 1、Cxca、IFNg2b、IgM和IgZ 1)的表達(dá)水平(P㩳0.05);SVCV對免疫后的鯉攻毒后,純G亞單位疫苗浸浴和注射免疫最高濃度(30 mg/L)或最高劑量組(12μg/尾)的免疫保護(hù)率分別僅為19.2%和34.6%,而SWCNTs-MG疫苗浸浴和注射免疫最高濃度或者劑量組的免疫保護(hù)率分別為63.5%和73.1%。3.免疫增效機(jī)制研究采用熒光標(biāo)記技術(shù),用異硫氰酸熒光素(FITC)分別對4種疫苗:G(糖蛋白)、MG(甘露糖化糖蛋白)、SWCNTs-G(碳納米管載糖蛋白)和SWCNTs-MG(碳納米管載甘露糖化糖蛋白))進(jìn)行標(biāo)記。通過免疫熒光和活體成像等技術(shù),研究上述4種疫苗在鯉巨噬細(xì)胞和體內(nèi)各組織器官中的遞呈和代謝作用規(guī)律。結(jié)果顯示:在細(xì)胞水平,鯉巨噬細(xì)胞對SWCNTs-MG的攝取量顯著高于其他疫苗組(G、MG和SWCNTs-G)(P㩳0.01);在個(gè)體水平,鯉的腎臟和脾臟對SWCNTs-MG的攝取量也顯著高于其他疫苗組(P㩳0.01)。并且SWCNTs-MG可以在浸浴免疫6 h內(nèi)從鰓、體表、腸道等部位進(jìn)入魚體體內(nèi),并呈遞到各組織器官。4.免疫方案優(yōu)化從浸浴免疫濃度(30、40和50 mg/L)、免疫密度(8、24和48尾/L)和免疫時(shí)間(6、12和24 h)這3方面對免疫方案進(jìn)行優(yōu)化。通過血清抗體效價(jià)變化和病毒攻毒對不同的免疫方案進(jìn)行評估。結(jié)果顯示:最高的免疫保護(hù)率為84.38%,相對應(yīng)的免疫方案為免疫濃度40 mg/L、浸浴密度8尾/L、浸浴時(shí)間12 h;最低的免疫保護(hù)率(51.04%)對應(yīng)的免疫方案為免疫濃度50 mg/L、浸浴密度48尾/L、浸浴時(shí)間6 h。綜合各因素考慮,最優(yōu)的免疫方案為:免疫濃度30 mg/L,浸浴密度24尾/L,鯉經(jīng)疫苗浸浴免疫12 h,保護(hù)率可達(dá)83.33%。綜上所述,本論文構(gòu)建的靶向性碳納米管載疫苗系統(tǒng)主要是通過提高疫苗進(jìn)入魚體內(nèi)的含量并增強(qiáng)對抗原呈遞細(xì)胞的提呈來提高對鯉的免疫保護(hù),實(shí)現(xiàn)對SVC的高效防治。該項(xiàng)研究成果不但可以為水產(chǎn)動物靶向性納米載疫苗系統(tǒng)的應(yīng)用提供理論依據(jù)和研究模板,而且也對保障水產(chǎn)品安全、生態(tài)安全和水產(chǎn)養(yǎng)殖健康發(fā)展具有重要的意義。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S943

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王德康;;豬常用疫苗的使用方法[J];青海農(nóng)牧業(yè);2008年04期

2 王艷慧;;基層動物防疫疫苗的管理及相關(guān)問題思考[J];飼料博覽;2019年02期

3 張芳;李玉;;小兒二類疫苗接種現(xiàn)狀調(diào)查及其相關(guān)影響因素分析[J];南昌大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2019年01期

4 瑪依努爾·阿不都克力木;梁靜;王培生;陳保林;尹鈺;;烏魯木齊市2012—2016年兒童入托入學(xué)預(yù)防接種查驗(yàn)情況[J];中國學(xué)校衛(wèi)生;2017年09期

5 陳曉曉;;兒童疫苗接種的問題分析[J];科技風(fēng);2017年26期

6 楊媛;;流動兒童疫苗接種的及時(shí)率的影響因素分析[J];世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘;2018年17期

7 林玲;秦夢怡;胡曉江;;高校場域?qū)W(xué)生疫苗接種的影響[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(社會科學(xué)版);2018年03期

8 錢文昌;劉淑兵;王正奎;;淺議疫苗[J];中學(xué)生物學(xué);2017年12期

9 程宇航;陳寧;;國外一些國家對疫苗是怎樣進(jìn)行監(jiān)管的[J];老區(qū)建設(shè);2018年15期

10 吳科穎;;兒童流感疫苗接種干預(yù)在疾病預(yù)防中的應(yīng)用價(jià)值研究[J];世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘;2016年79期

相關(guān)會議論文 前10條

1 朱珊;方宇;常捷;余家樂;張愉;計(jì)文婧;楊世民;;西安市家長對兒童疫苗接種信心及影響因素調(diào)查[A];2018年中國藥學(xué)會藥事管理專業(yè)委員會年會暨學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2018年

2 ;疫苗守護(hù)生命 第三章 疫苗的能與不能 第一節(jié) 接種疫苗安全有效[A];科技民生報(bào)告叢書——疫苗守護(hù)生命[C];2018年

3 ;疫苗守護(hù)生命 附錄 疫苗接種之“你問我答” 第一問 疫苗問答之“接種疫苗,你知道嗎?”[A];科技民生報(bào)告叢書——疫苗守護(hù)生命[C];2018年

4 楊錫強(qiáng);;疫苗接種的不良反應(yīng)及其處理[A];中華醫(yī)學(xué)會第十五次全國兒科學(xué)術(shù)大會論文匯編（上冊）[C];2010年

5 萬朝敏;;疫苗接種在流感大流行群體防控中的作用[A];中華醫(yī)學(xué)會第十五次全國兒科學(xué)術(shù)大會論文匯編（上冊）[C];2010年

6 劉柏林;熊亞軍;唐有智;唐孝富;;合川區(qū)適齡兒童卡介疫苗接種成功率調(diào)查分析[A];重慶市預(yù)防醫(yī)學(xué)會2012年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2012年

7 ;疫苗守護(hù)生命 附錄 疫苗接種之“你問我答” 第四問 疫苗問答之“關(guān)愛特殊疾病人群”[A];科技民生報(bào)告叢書——疫苗守護(hù)生命[C];2018年

8 ;疫苗守護(hù)生命 附錄 疫苗接種之“你問我答” 第五問 疫苗問答之“世界這么大,你想去哪兒看看”[A];科技民生報(bào)告叢書——疫苗守護(hù)生命[C];2018年

9 陳賢希;陳波;;疫苗藥品管理與應(yīng)用存在的問題及對策[A];2013年“全國醫(yī)院藥學(xué)（藥學(xué)服務(wù)與實(shí)踐）學(xué)術(shù)會議”論文集[C];2013年

10 ;疫苗守護(hù)生命 第一章 免疫系統(tǒng)守護(hù)人類健康 第三節(jié) 接種疫苗的歷史[A];科技民生報(bào)告叢書——疫苗守護(hù)生命[C];2018年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 本報(bào)記者 齊欣;進(jìn)口疫苗跑步上市供需平衡迎考[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2019年

2 記者 奚振海;我區(qū)加強(qiáng)疫苗監(jiān)管工作[N];廣西日報(bào);2019年

3 公職人員 木須蟲;讓疫苗信息真正可追溯[N];健康報(bào);2019年

4 本報(bào)記者 陳燕飛;我國疫苗開啟走向世界大門[N];中國醫(yī)藥報(bào);2018年

5 中國科學(xué)技術(shù)發(fā)展戰(zhàn)略研究院科技預(yù)測與評價(jià)研究所副研究員 張俊祥;“十二五”,疫苗產(chǎn)業(yè)要“突圍”[N];科學(xué)時(shí)報(bào);2010年

6 本報(bào)駐加拿大特約記者 陶短房 本報(bào)駐德國特約記者 青木 本報(bào)駐日本特約記者 黃文煒 本報(bào)記者 白云怡 范凌志;打消“疫苗恐慌”，各國都出重拳[N];環(huán)球時(shí)報(bào);2018年

7 胡浩;歐美民粹主義再掀反疫苗運(yùn)動[N];環(huán)球時(shí)報(bào);2019年

8 國家藥品監(jiān)督管理局信息中心 張s

本文編號：2726923