【摘要】：包括白細(xì)胞介素(Interleukin)和干擾素(Interferon)在內(nèi)的細(xì)胞因子(cytokines)具有調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫等多種功能。眾多細(xì)胞因子在生物體內(nèi)通過多種分泌方式如旁分泌、自分泌等發(fā)揮作用,形成了極為復(fù)雜的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò),參與生物體各種重要的生理功能。魚類作為最低等的脊椎動物,既具有固有免疫同時(shí)也具有適應(yīng)性免疫,是免疫進(jìn)化研究中極為重要的研究對象。本文以模式動物斑馬魚為研究對象,通過生物信息學(xué)分析獲得了一個(gè)魚類中特異存在的新型細(xì)胞因子,該細(xì)胞因子在基因結(jié)構(gòu)上與斑馬魚白細(xì)胞介素或干擾素存在相似性,且與斑馬魚白細(xì)胞介素22、白細(xì)胞介素26、伽馬干擾素I及其受體相鄰位于斑馬魚4號染色體上,所以我們暫將其命名為FIL(Fish-specific Interleukin/Interferon like molecule)。為進(jìn)一步探究該新型細(xì)胞因子的功能,我們首先通過RACE技術(shù)獲得FIL基因全長1243bp,其中包括CDS區(qū)639bp,隨后通過熒光定量PCR檢測FIL在健康斑馬魚各組織中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示FIL在健康斑馬魚的后腸、鰓、皮膚等粘膜組織中表達(dá)量較高。接著我們分別用POLY I:C、遲緩型愛德華氏菌(Edwardsiella tarda,Et)、鯉春病毒血癥病毒(SVCV)三種刺激物腹腔注射感染斑馬魚,經(jīng)熒光定量PCR檢測,結(jié)果顯示,FIL在斑馬魚經(jīng)病毒及其類似物感染后,在脾臟中迅速表達(dá),在腸中表達(dá)量較低。在細(xì)菌感染后,FIL主要在粘膜組織中發(fā)揮免疫作用。為進(jìn)一步探究FIL的生物學(xué)功能,我們構(gòu)建得到FIL的原核重組質(zhì)粒和真核重組質(zhì)粒,且成功表達(dá)純化獲得原核、真核重組蛋白。同時(shí)我們制備了斑馬魚FIL的多克隆抗體,經(jīng)Western blot檢測表明該多克隆抗體可特異性識別FIL重組蛋白。隨后我們將純化后的原核表達(dá)蛋白按照不同梯度刺激斑馬魚ZF4細(xì)胞系,以了解在細(xì)胞水平上FIL蛋白的生物活性及生物學(xué)功能。將刺激后細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測錄,結(jié)果顯示FIL在斑馬魚抗病毒免疫及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用。我們選取相應(yīng)靶標(biāo)基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證,進(jìn)一步印證了轉(zhuǎn)錄組所得結(jié)果。緊接著,我們希望通過解析FIL分子晶體結(jié)構(gòu)的方式進(jìn)一步鑒定其分類學(xué)地位。我們對純化所得的高純度原核蛋白進(jìn)行結(jié)晶,獲得了質(zhì)量較高的蛋白晶體,并對該晶體進(jìn)行光學(xué)衍射,收集到了該晶體的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù),但通過與蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中的其他蛋白序列進(jìn)行對比,我們發(fā)現(xiàn)盡管斑馬魚FIL基因在氨基酸序列上與白細(xì)胞介素及干擾素相似度較高,但在蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測上與二者同源性較低。因此我們需要獲得FIL蛋白的硒代衍生物并獲得其晶體,進(jìn)一步進(jìn)行衍射,硒代蛋白結(jié)晶的條件摸索工作在本文中得以體現(xiàn),結(jié)晶衍射數(shù)據(jù)待獲得。通過本實(shí)驗(yàn)一系列工作,我們對斑馬魚新型細(xì)胞因子FIL的生物化學(xué)功能、基因結(jié)構(gòu)及蛋白構(gòu)象有了進(jìn)一步的鑒定,為該細(xì)胞因子的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。S100家族蛋白是一組小的酸性多肽,在調(diào)節(jié)生理過程的許多方面具有多種功能。它們結(jié)構(gòu)保守,具有兩個(gè)EF-指針,對于鈣介導(dǎo)的功能十分重要。已知S100家族蛋白參與宿主防御,例如調(diào)節(jié)鈣止血和細(xì)胞遷移。盡管已經(jīng)在硬骨魚中描述了S100家族基因,但它們在免疫防御中的作用研究很少。我們在斑馬魚中測定了13個(gè)S100的cDNA序列,并確認(rèn)了它們所在的基因組。重新分析S100基因座的基因同源性揭示了Chr16和Chr19中存在兩個(gè)主要S100基因座,其中包含13個(gè)串聯(lián)連接的S100基因的染色體被認(rèn)為與人Chr1中的S100基因座共享共同起源。可以推測兩個(gè)S100斑馬魚基因座在硬骨魚特異性全基因組復(fù)制事件期間從單個(gè)基因座進(jìn)化而來。似乎人類S100G和S100P的同源物已經(jīng)在斑馬魚中丟失了。S100基因在中樞(頭腎和脾臟)和粘膜(鰓和后腸)免疫器官中檢查組成型表達(dá),在粘膜組織中相對高表達(dá)。腹膜內(nèi)注射poly(I:C)導(dǎo)致腸道中大多數(shù)S100基因的上調(diào),特別是誘導(dǎo)S100V2和S100Z的表達(dá)顯著升高,注射后48小時(shí)的脾臟表達(dá)也顯著升高。在用鯉春病毒血癥病毒(SVCV)刺激斑馬魚的實(shí)驗(yàn)中,在感染后第1天和第7天之間脾臟中大多數(shù)S100基因的表達(dá)增加,觀察到S100A10a,S100A10b,S100A10ICN1,S100A10U,S100V1和S100Z的一致誘導(dǎo)。腹腔注射E.tarda可下調(diào)腸道中S100基因的表達(dá),但在注射后72小時(shí)脾臟中的S100基因上調(diào)。我們發(fā)現(xiàn),魚類S100基因與哺乳動物對應(yīng)物有共同的起源。斑馬魚S100基因受細(xì)菌和病毒病原體的差異調(diào)節(jié),參與魚類的免疫防御。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S917.4
【圖文】：

采用隱馬爾科夫模型對FIL信號肽序列的預(yù)測

圖 2-2：采用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對 FIL 信號肽序列的預(yù)測.2 斑馬魚 FIL 蛋白同源性及結(jié)構(gòu)域比對通過 NCBI 進(jìn)行全基因序列比對，斑馬魚 FIL 位于第 4 號染色體上，位于

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 王俊相;李玉萍;孔令富;李蓮軍;;魚類免疫系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J];四川畜牧獸醫(yī);2010年07期

2 尹湘艷;胡國斌;張建業(yè);劉秋明;;魚類干擾素系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J];生命科學(xué)儀器;2009年09期

本文編號：2723114