【摘要】：對蝦是世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)當(dāng)中重要的經(jīng)濟(jì)品種,是深受消費者喜愛的高品質(zhì)水產(chǎn)品。尤其是在一些沿海發(fā)展中國家,對蝦養(yǎng)殖既提供了國民生存所需的基本蛋白源,又創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。而對蝦養(yǎng)殖在我國同樣具有重要的地位,早在上世紀(jì)七十年代,我國便開展了中國對蝦的人工育苗工作,八十年代形成規(guī)�；酿B(yǎng)殖,在經(jīng)歷了蝦病大爆發(fā)后引進(jìn)了凡納濱對蝦,之后穩(wěn)步提升,到現(xiàn)在我國已經(jīng)成為世界上最大的對蝦養(yǎng)殖國家,海水養(yǎng)殖面積達(dá)到23萬公頃,育苗超過1萬億尾。但即便如此,我國每年仍需進(jìn)口大量對蝦來滿足國內(nèi)的消費需求。而1993年以后,病害問題層出不窮,已知病原的持續(xù)傳播,新發(fā)疫病的頻繁暴發(fā),屢屢給產(chǎn)業(yè)帶來嚴(yán)重的損失,使產(chǎn)業(yè)和養(yǎng)殖環(huán)境面臨巨大的挑戰(zhàn)。而對蝦的病毒病因其發(fā)病迅速,傳播能力強,宿主寬泛,又無明確的防治辦法,對產(chǎn)業(yè)的影響尤為嚴(yán)重。新發(fā)病原因為生物學(xué)特性、感染方式的不確定,同時因為傳統(tǒng)病毒學(xué)研究手段的局限,給新病原的及時發(fā)現(xiàn)與防控帶來了極大的挑戰(zhàn)。對于未知病毒的挖掘,目前只能依靠電子顯微鏡的觀察,這種通過形態(tài)觀察來辨別新病毒的方式難度較大,準(zhǔn)確性差。即使觀測到病毒顆粒,也無法準(zhǔn)確判斷病毒的分類,難以得到病毒的核酸序列,給進(jìn)一步的研究帶來困難。病毒宏基因組學(xué)是研究病毒組成的一種新技術(shù),在病毒(已知或未知)的及時發(fā)現(xiàn)與動態(tài)監(jiān)測等方面具有突出的優(yōu)勢。此技術(shù)已經(jīng)在人類醫(yī)學(xué),獸醫(yī)領(lǐng)域以及一些水產(chǎn)魚類上得到了應(yīng)用,但對蝦病害的研究當(dāng)中卻鮮有相關(guān)報道。本文首次對國內(nèi)發(fā)病的養(yǎng)殖對蝦樣品進(jìn)行病毒宏基因組學(xué)的處理和測序,探究發(fā)病對蝦樣品中病毒的組成情況。從測序數(shù)據(jù)中挖掘出疑似致病性的對蝦病毒,并針對單個病毒進(jìn)行病原的分離鑒定,探究新病毒與對蝦病癥的關(guān)系。同時,調(diào)查新病毒的感染和流行情況,為對蝦養(yǎng)殖業(yè)中這些未知病原的防控提供理論基礎(chǔ)。2014-2015年間,采集了國內(nèi)七批發(fā)病的對蝦樣品,經(jīng)OIE推薦和文章報道的PCR/RT-PCR方法檢測,無與發(fā)病癥狀對應(yīng)的病原檢出。為進(jìn)一步探究發(fā)病對蝦中潛在的病原,對七批對蝦樣品進(jìn)行了病毒組提純、病毒組核酸的提取、RNA的反轉(zhuǎn)錄、DNA的錨定引物錨定和第二條鏈的合成、SISPA-PCR擴增、Illumina Hi Seq 2500宏基因組測序和數(shù)據(jù)拼接注釋。經(jīng)處理后的樣品測序數(shù)據(jù)中,注釋到病毒的reads數(shù)約占各樣品總數(shù)據(jù)的25%-80%。注釋到的病毒中,ds DNA病毒占78.7%,ss DNA病毒占17%,RNA病毒僅占4%。其中,S2樣品中有50%以上的reads注釋到虹彩病毒科,S6樣品中有70%以上的reads注釋到細(xì)小病毒科,其余樣品中各病毒科組成較為相近,其中皰疹凈病毒科reads數(shù)均占比最高。對S2樣品中含量最高的虹彩病毒科reads,S1和S3樣品中含量最高的皰疹病毒科reads,S3樣品中含量最高的一株噬菌體reads,以及S7樣品中含量最高的Decapod penstyldensovirus 1的reads進(jìn)行提取拼接和PCR驗證。其中虹彩病毒科reads經(jīng)拼接后,獲得643條序列片段,長度10,223bp-100bp,其中的一條長6,655bp片段的4個區(qū)域均通過PCR進(jìn)行了驗證。皰疹病毒科的reads經(jīng)拼接后,獲得992條序列片段,長度1,828bp-100bp,其中兩條最長的片段的3個區(qū)域均通過PCR進(jìn)行了驗證。此外,通過數(shù)據(jù)的提取和拼接,還獲得了S3樣品中一株噬菌體Vibrio phage VP93的全序列,長43,640bp;以及S7樣品中病毒Decapod penstyldensovirus1的全序列,長4,062bp。這是國內(nèi)首次通過病毒宏基因組學(xué)技術(shù)分析養(yǎng)殖對蝦樣品的病毒組成,挖掘出了虹彩病毒,皰疹病毒等可疑的病毒序列并經(jīng)過了PCR的驗證,這些病毒物種極有可能是養(yǎng)殖對蝦的潛在病原,應(yīng)引起產(chǎn)業(yè)的重視。S2(編號20141215)樣品病毒組數(shù)據(jù)中,虹彩病毒科的序列占比高,獲得的拼接序列較多,極有可能存在未被報道過的潛在病原。本批樣品自2014年12月15日采集自浙江省的一個對蝦養(yǎng)殖場中,發(fā)病對蝦出現(xiàn)生長緩慢,肝胰腺色淺萎縮,大量死亡等癥狀。對固定的對蝦樣品頭胸部進(jìn)行組織病理切片和H-E染色,發(fā)現(xiàn)造血組織、鰓絲、肝胰腺血竇和附肢等部位的細(xì)胞出現(xiàn)了核固縮現(xiàn)象,同時細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在嗜堿性包涵體,這些病理癥狀在之前報道的蝦病中未曾出現(xiàn)過。通過對拼接的序列進(jìn)行BLASTX比對,我們獲得了一株疑似虹彩病毒的MCP基因序列和部分ATP酶序列�；贛CP和ATP酶基因序列與虹彩病毒科同源物種進(jìn)行進(jìn)化樹分析,發(fā)現(xiàn)此病毒處于虹彩病毒科的一個新的分支,不屬于已經(jīng)劃分的5個病毒屬。進(jìn)一步通過病毒顆粒的粗提以及組織的超薄切片,透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)感染對蝦組織中存在大量大顆粒的二十面體病毒,其角對角直徑為158.6±12.5nm(n=30),邊對邊直徑為143.6±10.8nm(n=30),病毒內(nèi)有一個直徑85.8±6.0nm(n=30)的內(nèi)核。而通過模擬自然的非侵入性方式和肌肉注射方式進(jìn)行人工感染實驗,發(fā)現(xiàn)均可以復(fù)制出原始樣品的癥狀,且造成健康對蝦感染15天后100%的死亡。通過超薄切片的觀察確定,此病毒感染蝦的血淋巴細(xì)胞,且有大量病毒游離于組織的血竇中。進(jìn)一步對拼接的DNA序列進(jìn)行PCR驗證和一代測序填補,獲得了長為165,809bp的全基因組序列。其基因組的G+C含量占34.6%,經(jīng)Dot plot分析,最長重復(fù)序列長320bp,此外還有一些直接、反向和回文重復(fù)序列存在。共預(yù)測有170個ORF,102個是正向,68個是反向,共有11對ORF存在相互重疊,有63個ORF通過比對預(yù)測出了相應(yīng)的基因功能,包括ATP酶,DNA聚合酶和MCP蛋白等。分別通過27個基因和16個基因的多基因進(jìn)化樹比對,發(fā)現(xiàn)本株虹彩病毒屬于Iridoviridae的一個新的病毒屬�；谝陨辖Y(jié)果,本文發(fā)現(xiàn)并鑒定了一種感染凡納濱對蝦的新型虹彩病毒,暫命名為蝦血細(xì)胞虹彩病毒(Shrimp hemocyte iridescent virus,SHIV),并建議將其劃分到一個新的病毒屬—蝦虹彩病毒屬Xiairidovirus。通過對人工感染SHIV的凡納濱對蝦進(jìn)行血淋巴液的采集,血細(xì)胞的離心去除,濾膜的過濾,高速離心粗提。粗提液經(jīng)蔗糖密度梯度離心后,離心管中出現(xiàn)四條肉眼可見的條帶,分別分布在30%,40%和50%區(qū)域內(nèi)。其中條帶3最濃,分布區(qū)域也最集中。對離心管各位置的懸液進(jìn)行OD280和浮力密度的測定,得出吸光度和浮力密度曲線,其中吸光度曲線有4個波峰與條帶相對應(yīng),4個波峰處的浮力密度分別為1.07g/cm3,1.17 g/cm3,1.23 g/cm3和1.32 g/cm3。經(jīng)過磷鎢酸負(fù)染和透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),條帶3中SHIV病毒顆粒最密集,病毒顆粒呈典型的二十面體,核衣殼內(nèi)部能觀察到內(nèi)界膜和核心。將純化的條帶3處懸液進(jìn)行SDSPAGE,染色和脫色后,得到20條肉眼可見的蛋白條帶,大小從180k Da至20k Da左右。對20個條帶分別進(jìn)行切膠和蛋白質(zhì)譜分析比對,獲得了各個條帶的比對注釋結(jié)果,其中包含宿主凡納濱對蝦的血藍(lán)蛋白和SHIV的MCP蛋白等。通過以上實驗,證明了純化得到的病毒顆粒即是測序數(shù)據(jù)中拼接得到的SHIV。針對SHIV的MCP基因序列,設(shè)計原位雜交探針,對原始樣品及人工感染樣品進(jìn)行原位雜交驗證,結(jié)果在造血組織、鰓絲、肝胰腺血竇和附肢中均發(fā)現(xiàn)了藍(lán)色的雜交信號,證實了SHIV在對蝦體內(nèi)的感染,同時確定了其感染部位。根據(jù)ATP酶基因設(shè)計引物,建立了特異性的高靈敏度套式PCR檢測方法,檢測極限可以達(dá)到36fg感染對蝦的總DNA。與本實驗室建立的熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測比對,建立的套式PCR方法的檢測靈敏度為97.6%,檢測特異性為98.3%。應(yīng)用此套式PCR檢測方法對國內(nèi)養(yǎng)殖對蝦樣品進(jìn)行SHIV的檢測調(diào)查,發(fā)現(xiàn)除凡納濱對蝦外,養(yǎng)殖中國對蝦和羅氏沼蝦也檢測到SHIV陽性,所有樣品總陽性率達(dá)到15.8%。其中陽性樣品在河北省,山東省,浙江省和廣東省分布較廣泛,可見此病原已在國內(nèi)沿海養(yǎng)殖場廣泛傳播。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S945.4
【圖文】：

集不久的對蝦，經(jīng)拍照和癥狀記錄后，沿頭胸部的中軸如圖 1 所示）。一半樣品立即用 3-10 倍體積的 Davly 固定液保存固定，待浸泡固定 24 小時之后更換為理學(xué)研究。其中，Davideson’s 固定液保存的樣品用）染色法染色，RNAFriendly 固定液保存的樣品用 原位雜交研究。另一半樣品，首先切取病變組織（M 固定液保存，用作超薄切片和透射電鏡觀察。然絲和肌肉等），保存于 3-10 倍體積的 95%乙醇中，存于-80℃（如有條件，可先液氮速凍，再轉(zhuǎn)入-80℃

上海海洋大學(xué)博士學(xué)位論文毒組樣品的透射電鏡觀察理的病毒懸液，經(jīng)過銅網(wǎng)吸附，磷鎢酸負(fù)染，在電鏡下如圖 2-2 所中均可以看到大小不同的疑似病毒樣顆粒。其中 A 圖所示的 S 40-60nm 的二十面體顆粒；B 圖所示 S2 樣品中，同樣有接近 顆粒；C 和 D 圖所示的 S3 和 S4 樣品有 100nm 左右疑似皰疹病所示為 S7 樣品中 30nm 左右的二十面體顆粒。處理過的病毒組的大多是二十面體，未見到桿狀等其他形狀的顆粒。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2722916