發(fā)布時(shí)間：2020-06-18 13:24

【摘要】：酯酶(Esterase)是一種水解酶,可在水分子的參與下,經(jīng)由水解作用,將甘油三酯、磷脂和膽固醇酯等酯類切割成酸類與醇類。此類酶參與多種生物化學(xué)反應(yīng),依其專屬受質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),以及功能而有不同。催化水解各種酯鍵的一類酶。通常還包括催化水解羧酸酯和磷酸酯的二類酶。在催化羧酸酯的酯酶中,最常見的如脂肪酶,可催化水解甘油三酯為甘油和脂肪酸。酯酶的催化作用對食物中脂肪的吸收、平衡能量和血漿脂蛋白的代謝起著重要的作用。目前針對酯酶的研究發(fā)現(xiàn),具上述功能的酶包括脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase, LPL)、肝脂酶(Hepatic lipase, HL)、內(nèi)皮脂酶(Endothelial lipase, EL)和胰脂酶(Pancreatic lipase,PL)等。本研究以吉富羅非魚為研究對象,首次采用RT-PCR和RACE法從吉富羅非魚(farmed tilapia)肝臟克隆得到HL、LPL基因全序列。并通過qRT-PCR技術(shù)分析不同脂肪、膽堿以及投飼頻率、投喂水平下HL和LPL在肝臟中表達(dá)的豐度。主要研究結(jié)果如下：1.HL基因全長編碼區(qū)序列片段的克隆。測序結(jié)果顯示吉富羅非魚HL基因包含全長編碼區(qū)片段大小為1872bp,其中5'非翻譯區(qū)(5'-UTR)為217bp,3'非翻譯區(qū)(3-UTR)為176bp,開放閱讀框(ORF)為1479bp,編碼493個(gè)氨基酸,蛋白質(zhì)分子量為6.3104kD。PolyA加尾信號為AATAAA。2.HL基因生物信息學(xué)分析。序列同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,吉富羅非魚與羅非魚、大口黑鱸、鱖魚、真鯛、斜帶石斑魚、鰱魚HL基因序列同源性較高,分別為96.6%、84.68%、80.89%、79.48%、76.52%、75.89%;與人、大鼠、小鼠和中華鱘HL基因同源性較低,分別為48.7%、48.99%、49.41%、60.9%。吉富羅非魚與羅非魚、大口黑鱸HL氨基酸序列同源性最高,而與人、老鼠、中華鱘HL氨基酸序列同源性最低。這與其親緣遠(yuǎn)近關(guān)系相符合,表明吉富羅非魚HL基因在進(jìn)化中相對保守；使用ExPASy在線軟件分析HL基因的氨基酸組成,結(jié)構(gòu)顯示,該HL由486個(gè)氨基酸組成,最高含量的氨基酸是亮氨酸(10.1%),甘氨酸(7.6%)為第二多含量氨基酸,最低含量的氨基酸是色氨酸(1.9%)。功能分析發(fā)現(xiàn),HL氨基酸理論等電點(diǎn)為8.72,分子量為6.3104kD,負(fù)電荷氨基酸殘基總數(shù)(AsP+Glu)為54個(gè),正電荷氨基酸殘基總數(shù)(Arg+Lys)為62個(gè),不穩(wěn)定系數(shù)39.65,脂肪系數(shù)84.24,總水平疏水性-0.328。應(yīng)用SignIP程序?qū)L蛋白N—末端信號肽進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果顯示,吉富羅非魚HL含有30個(gè)氨基酸信號肽。功能結(jié)構(gòu)表明,吉富羅非魚和其他魚類HL基因氨基酸序列中均存在脂質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)、N-糖基化位點(diǎn)、保守的半胱氨酸位點(diǎn)和催化位點(diǎn)。HL的蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)分析顯示,無規(guī)則卷曲蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)為主,α-螺旋和延伸帶散布于整個(gè)蛋白中。3.LPL基因全長編碼區(qū)序列片段的克隆。測序結(jié)果顯示吉富羅非魚LPL基因包含全長編碼區(qū)片段大小為2300bp,其中5'非翻譯區(qū)(5'-UTR)為126bp,3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)為629bp,開放閱讀框(ORF)為1545bp,編碼515個(gè)氨基酸,蛋白質(zhì)分子量為5.813596kD。4.LPL基因生物信息學(xué)分析。LPL基因的序列同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析,發(fā)現(xiàn)吉富羅非魚LPL氨基酸序列與哺乳動(dòng)物同源性為56.12%～56.54%,與雞同源性為57.35%,與真骨魚斑馬魚、鱖魚、大口黑鱸等同源性為67.51%-92.31%,表明LPL在進(jìn)化中相對保守。其中吉富羅非魚與鱖魚LPL氨基酸序列同源性最低,為67.51%,與大口黑鱸同源性最高,達(dá)到92.31%。通過相關(guān)軟件進(jìn)行氨基酸序列對比,結(jié)果顯示本研究克隆的吉富羅非魚肝臟LPL氨基酸與其他物種相比,具有很強(qiáng)的保守性,從中可以證明,本研究克隆得到的正是吉富羅非魚的LPL基因。應(yīng)用MEGA3.1軟件N-J方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示真鯛、斜帶石斑魚先聚為一支再和吉富羅非魚聚為一支,而小鼠和大鼠聚為一支再和原雞聚為一支,從形態(tài)學(xué)和生化特征分類來看,本研究得到系統(tǒng)進(jìn)化樹符合相關(guān)的規(guī)律,進(jìn)一步說明克隆的為吉富羅非魚LPL基因。使用相關(guān)軟件進(jìn)行LPL氨基酸分析,結(jié)果顯示,該蛋白質(zhì)由513個(gè)氨基酸組成,其中蘇氨酸含量最高為9.0%,其次是亮氨酸7.8%,半胱氨酸含量最低(1.9%)。功能分析發(fā)現(xiàn),LPL氨基酸理論等電點(diǎn)為8.54,分子量為57.8538kDa,負(fù)電荷氨基酸殘基總數(shù)(AsP+Glu)為53個(gè)正電荷氨基酸殘基總數(shù)(Arg+Lys)為58個(gè),不穩(wěn)定系數(shù)30.98,脂肪系數(shù)79.81,總水平疏水性-0.323。信號肽研究發(fā)現(xiàn),吉富羅非魚LPL含有24個(gè)氨基酸信號肽的蛋白質(zhì)。功能結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),吉富羅非魚的LPL基因氨基酸序列中與其他魚類一樣都發(fā)現(xiàn)存在N-糖基化位點(diǎn)、保守的半胱氨酸位點(diǎn)、脂質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)和催化位點(diǎn)。LPL的蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)分析顯示,無規(guī)則卷曲蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)為主,α-螺旋和延伸帶散布于整個(gè)蛋白中。5.不同膽堿水平、脂肪水平和投喂頻率、投喂水平下肝臟中HL活性的表達(dá)。應(yīng)用qRT-PCR的方法檢測了吉富羅非魚肝臟中不同膽堿水平、脂肪水平和投喂頻率、投喂水平下肝臟中肝脂酶活性的表達(dá),結(jié)果顯示膽堿水平分別為750mg/kg和1000mg/kg時(shí),吉富羅非魚肝臟HL基因表達(dá)量隨著脂肪水平(4%、8%和12%)的上升而增加,組間差異極顯著(P0.01)。當(dāng)脂肪水平為相同4%時(shí),吉富羅非魚肝臟HL基因表達(dá)量隨著膽堿水平(500mg/kg、750mg/kg和1000mg/kg)的上升先下降后上升。而脂肪水平為8%和12%時(shí),肝臟HL基因表達(dá)量隨著膽堿水平一直處于上升的狀態(tài)；不同投喂水平和投喂頻率對吉富羅非魚肝臟HLmRNA表達(dá)的影響的實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)投喂頻率為2次/d時(shí),吉富羅非魚肝臟HLmRNA表達(dá)量隨著脂肪水平(2%～10%)的上升先下降后上升,除了脂肪水平為4%的時(shí)候,其他脂肪水平的肝臟HL mRNA的表達(dá)量均比對照組(2次/d,脂肪水平2%)高。其中脂肪水平10%與2%、8%之間,脂肪水平4%與6%之間均差異顯著(P0.05),4%與10%之間差異極顯著(P0.01)；投喂頻率為3次/d時(shí),各個(gè)脂肪水平肝臟HL mRNA表達(dá)量總體比對照組(2次/d,脂肪2%)高,且隨著脂肪含量的上升,肝臟HL mRNA表達(dá)量也呈現(xiàn)上升的趨勢。其中脂肪水平為2%與其他組之間,脂肪水平4%與8%、10%之間,脂肪水平6%與10%之間肝臟HL mRNA表達(dá)量差異極顯著(P0.01),脂肪水平8%與10%之間肝臟HLmRNA表達(dá)量差異顯著(P0.5),其他組之間差異不顯著P0.05)。6.不同膽堿水平、脂肪水平和投喂頻率、投喂水平下肝臟中LPL活性的表達(dá)。應(yīng)用qRT-PCR的方法檢測了吉富羅非魚肝臟中不同膽堿水平、脂肪水平和投喂頻率、投喂水平下肝臟中肝脂酶活性的表達(dá),結(jié)果顯示,膽堿水平為500mg/kg時(shí),吉富羅非魚肝臟LPL基因表達(dá)量隨著脂肪水平(4%、8%和12%)的上升先下降后上升。膽堿水平為750mg/kg時(shí),吉富羅非魚肝臟LPL基因表達(dá)量隨著脂肪水平(4%、8%和12%)的上升而下降,各組之間差異極顯著P0.01)。膽堿水平為1000mg/kg時(shí),肝臟LPL基因表達(dá)量隨著脂肪水平(4%、8%和12%)的上升而呈現(xiàn)上升的趨勢,各組之間差異極顯著(P0.01)；分析脂肪不變,肝臟中LPL基因表達(dá)量的變化情況為,脂肪水平為4%時(shí),肝臟中LPL基因表達(dá)量隨著膽堿水平的上升而先上升后下降,但脂肪水平為12%時(shí),肝臟中LPL基因表達(dá)先下降再上升。脂肪水平為8%時(shí),隨著膽堿水平的上升,肝臟中LPL基因表達(dá)也一直呈現(xiàn)上升的趨勢；投喂頻率2次/d情況下,隨著飼料中脂肪水平增加,吉富羅非魚肝臟LPL mRNA表達(dá)量先下降再上升繼而下降又上升的多變趨勢,各組之間差異極顯著P0.01)。當(dāng)投喂頻率3次/d,脂肪水平為2%和4%時(shí),吉富羅非魚肝臟LPL mRNA表達(dá)量均低于對照組(2次/d、脂肪水平2%),且隨著脂肪水平的上升而下降組間差異不顯著P0.05)。但當(dāng)脂肪水平為6%至10%時(shí),吉富羅非魚肝臟LPL mRNA表達(dá)量隨著脂肪水平的上升而呈現(xiàn)上升的趨勢,且表達(dá)量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組,各組之間差異極顯著(P0.01)。
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S965.125
【圖文】：

Ｗ吉富羅非魚肝臟ｃＤＮＡ為模板進(jìn)行ＰＣ民反應(yīng)，分別使用簡并引物ＨＬ０１Ｆ、逡逑ＨＬ０２Ｒ和ＬＰＬ０１ＦＸＰＬ０２民進(jìn)行ＰＣ民擴(kuò)增，分別獲得約４１０ｂｐ和１５４５ｂｐ的ＰＣＲ逡逑產(chǎn)物（圖３－２），均與目的片段長度相符。切下目的擴(kuò)增帶，膠回收后與ｑＣＲ邋２．１逡逑載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ，并用上述正反向引物，通過菌液ＰＣ民反應(yīng)逡逑檢測得到陽性克隆。陽性克隆由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測序，所得序列逡逑在ＮＣＢＩ網(wǎng)站上ＢＬＡＳＴ確認(rèn)。逡逑；Ｇ（）ｂｐ邐sD貨逡逑４ｉ0ｂｐ邐４００昧逡逑WW逡逑Ａ邐Ｂ逡逑圖３－２吉富\ �。龋毯停蹋校袒蜃CＮＡ楊巳、片段ＲＴ－ＰＣＲ擴(kuò)X椊峁義希灣�，标讛D腫恿�；Ａ－１邋，吉笁慕�?jì)傹x痰拿瘢裕校茫也錚唬攏卞�，吉富罗非鱼ＬＰＬ德欈Ｔ－ＰＣＡx義喜镥義希牛紓澹常插澹粒恚穡歟椋媯椋悖幔簦椋錚鑠澹錚駑迦裕罰浚叮蓿澹。房諶緇緬澹齲體澹幔睿溴澹蹋校體澹紓澹睿邋義希汀停錚歟澹悖酰歟幔蟈澹鰨澹椋紓瑁翦澹螅簦幔睿洌幔潁洌�；Ａ－e瘢裕校妹皴澹穡潁錚洌酰悖翦澹錚駑澹齲�；n�，民Ｔ－ＰＣ民邋７w潁錚洌酰悖翦澹錚駑澹蹋校體義希ǎ玻╁危怠遙粒茫歐ɡ┰黽宦薹怯慊停蹋校袒潁茫模危粒怠┒隋義隙約宦薹怯愀臥嘧埽遙危兩蟹醋擠從�，其中ｃＤＮ窥捂k糜冢校茫依╁義顯觶捎茫裕幔耍幔遙徨澹擔(dān)保疲酰歟戾澹遙粒茫佩澹耄椋羰約梁型萍齜椒ǚ直鸞腥縵虜僮鰨哄義希保狀五澹校妹皴澹滓镥澹怠遙粒茫佩澹齲體澹牽櫻校卞寮板澹怠遙粒茫佩澹希酰簦澹蟈澹校潁椋恚澹蟈邐

本文編號：2719308