【摘要】：脂肪是水產(chǎn)動(dòng)物飼料的主要能源物質(zhì)之一,脂肪分解利用的第一個(gè)關(guān)鍵步驟是占脂肪主要成分的甘油三酯的水解,生成甘油和脂肪酸。本研究利用分子生物學(xué)手段,在中華絨螯蟹中克隆得到了三種甘油三酯水解酶(es_TGL1,es_TGL2和es_IL),并分析了這三種甘油三酯水解酶在中華絨螯蟹各組織中的和饑餓情況下的基因表達(dá)模式。采取營(yíng)養(yǎng)干預(yù)手段,全面的分析了中華絨螯蟹幼蟹飼料中新型的飼料添加劑——硫辛酸的最適添加量以及其代謝組學(xué)信息后,在不同脂肪含量和不同脂肪源的飼料中添加適量的硫辛酸,探究了中華絨螯蟹幼蟹在生長(zhǎng)、體成分、抗氧化能力、甘油三酯分解和脂肪酸組成等方面的響應(yīng)。通過(guò)新興的脂質(zhì)組學(xué)手段,分析了攝入四種具有代表性的脂肪源后,中華絨螯蟹肝胰腺不同類型脂質(zhì)的組裝和分配。研究結(jié)果不僅豐富了中華絨螯蟹甘油三酯水解以及脂肪酸在不同脂質(zhì)中的分配等相關(guān)知識(shí),也為中華絨螯蟹配合飼料的優(yōu)化和水產(chǎn)動(dòng)物飼料脂肪的高效利用提供了參考。1.中華絨螯蟹甘油三酯分解關(guān)鍵基因的鑒定與分析脂肪作為水產(chǎn)動(dòng)物飼料中的三大能源物質(zhì)之一,能夠?yàn)闄C(jī)體的生長(zhǎng)提供能量以及結(jié)構(gòu)性物質(zhì)等,機(jī)體對(duì)脂肪的利用的第一步便是對(duì)占主要成分的甘油三酯的動(dòng)用,而機(jī)體對(duì)甘油三酯的動(dòng)用包括對(duì)飼料中甘油三酯的水解和對(duì)機(jī)體儲(chǔ)存的甘油三酯的水解兩個(gè)方面。因此,我們?cè)谥腥A絨螯蟹體內(nèi)鑒定到了三種甘油三酯水解酶,分別命名為es_TGL1,es_TGL2和es_IL,通過(guò)保守區(qū)域的分析比對(duì),es_TGL1和es_TGL2屬于消化腺分泌的甘油三酯水解酶,負(fù)責(zé)食物中攝入的甘油三酯的水解利用,es_IL具有PLAT結(jié)構(gòu)域,屬于細(xì)胞內(nèi)的甘油三酯水解酶,負(fù)責(zé)水解體內(nèi)儲(chǔ)存的甘油三酯。es_TGL1全長(zhǎng)是2129 bp,包括82 bp的5’端和268 bp的3’端非編碼區(qū),其中1797 bp的開(kāi)放閱讀框,編碼599個(gè)氨基酸;es_TGL2全長(zhǎng)1423 bp,包括51 bp的5’端和103 bp的3’端非編碼區(qū),1266 bp的開(kāi)放閱讀框編碼422個(gè)氨基酸;es_IL全長(zhǎng)為1939 bp,包括132 bp的5’端和193 bp的3’端非編碼區(qū),其中1611 bp的開(kāi)放閱讀框編碼537個(gè)氨基酸。三個(gè)甘油三酯水解酶均屬于分泌型蛋白,具有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。NCBI的登錄號(hào)分別為MF182403,MF182404和MF182405。三個(gè)基因的組織分布結(jié)果表明,es_TGL1在鰓、胃、肝胰腺中具有較高的基因表達(dá)量,在圍心腔中表達(dá)量最低;es_TGL2在肌肉中的表達(dá)量最高,在肝胰腺和胃中次之,在圍心腔、眼柄和腸道中的表達(dá)量非常低;es_IL在肝胰腺中的表達(dá)量最高,在肌肉和胃中次之,而在其他四種組織中的表達(dá)量都非常低,在組織中的不同表達(dá)模式說(shuō)明這三種甘油三酯水解酶具有不同的組織特異性。經(jīng)過(guò)高脂飼料飼喂4周后的饑餓處理結(jié)果顯示,血清中的TG在饑餓兩周時(shí)有顯著的上升,血清甘油含量也在饑餓72小時(shí)和兩周時(shí)顯著升高,血清中游離脂肪酸隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng),先上升后下降;肝胰腺中TG含量隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減少,而甘油含量在48小時(shí)內(nèi)呈波動(dòng)變化,72小時(shí)后恢復(fù)至饑餓0小時(shí)的水平,肝胰腺中游離脂肪酸的含量在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間無(wú)顯著的差異。es_TGL1的表達(dá)量在饑餓6小時(shí)和12小時(shí)呈現(xiàn)顯著的上升,表達(dá)量在饑餓24小時(shí)過(guò)后逐漸降低;es_TGL2的表達(dá)量在饑餓6,12和24小時(shí)有顯著的上升,饑餓超過(guò)48小時(shí)后,也呈現(xiàn)顯著降低的趨勢(shì);es_IL在6,12和72小時(shí)的基因表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組,饑餓超過(guò)96小時(shí)后,開(kāi)始顯著的降低。綜上,中華絨螯蟹中鑒定到的三種甘油三酯水解酶,不同的組織特異性,提示研究甲殼動(dòng)物脂肪的代謝,除了把肝胰腺作為重點(diǎn)外,胃和肌肉也是不容忽視的兩種關(guān)鍵組織;隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng),消化腺甘油三酯水解酶的表達(dá)逐漸降低,并伴隨著機(jī)體儲(chǔ)脂階段性的被動(dòng)員用于機(jī)體的供能。2.中華絨螯蟹飼料中硫辛酸最適添加量及其代謝機(jī)制研究硫辛酸作為一種新型的飼料添加劑,是機(jī)體三羧酸循環(huán)中的重要輔酶,參與機(jī)體的能量代謝,因其口服效果較好,在醫(yī)藥和畜牧領(lǐng)域受到廣泛的關(guān)注,近些年,硫辛酸在水產(chǎn)動(dòng)物中的研究也逐漸受到人們的關(guān)注。本部分內(nèi)容探究了中華絨螯蟹幼蟹飼料中硫辛酸的最適添加量以及硫辛酸發(fā)揮作用的代謝組學(xué)機(jī)制。以0,300,600,1200,2400,4800和9600 mg/kg的飼料硫辛酸添加飼喂中華絨螯蟹幼蟹,經(jīng)過(guò)8周的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn),通過(guò)折線回歸方程,分別以增重率和特定生長(zhǎng)率為標(biāo)準(zhǔn),得到中華絨螯蟹幼蟹飼料中硫辛酸的最適添加量分別為1339.13和1574.09 mg/kg。各個(gè)處理組之間蟹體成分均無(wú)顯著差異。SOD和GSH-Px的活力均隨著硫辛酸添加劑量的增加呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì),在600 mg/kg的添加量中達(dá)到最高值;T-AOC同樣隨著硫辛酸添加量的增加而升高,在4800 mg/kg組最高;4800和9600 mg/kg的硫辛酸處理組的MDA含量顯著高于其他劑量添加組;GSH的含量在各個(gè)處理組之間無(wú)顯著的差異。肝胰腺總脂含量在300,600和1200 mg/kg硫辛酸添加組略高于其他處理組,但是在處理組之間無(wú)顯著的差異,而肝胰腺中甘油三酯的含量隨著硫辛酸添加劑量的增加而升高。甘油三酯分解相關(guān)基因的表達(dá)受飼料硫辛酸添加量的顯著影響,其中,es_TGL1,es_TGL2和es_IL在硫辛酸2400 mg/kg添加劑量組具有最高的基因表達(dá)量,且es_TGL1在2400 mg/kg硫辛酸添加劑量?jī)?nèi),其表達(dá)量隨著硫辛酸添加的增多而升高;es_DGL的基因表達(dá)量在硫辛酸添加劑量為1200 mg/kg組時(shí)具有最高值,但是與300和2400 mg/kg添加量組之間無(wú)顯著的差異;在300 mg/kg硫辛酸添加組,CPT-1具有顯著高于其他添加劑量處理組的mRNA表達(dá)量。將0和2400 mg/kg硫辛酸處理組中華絨螯蟹血清的代謝組學(xué)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析,共得到45個(gè)顯著差異的代謝物,硫辛酸添加組與對(duì)照組相比,有22個(gè)代謝物顯著增多,23個(gè)代謝物顯著減少,這些差異代謝物參與到的代謝通路主要涉及脂肪酸代謝(亞麻酸、花生四烯酸),氨基酸代謝(丙氨酸、組氨酸等),�；鈮A代謝,自噬和抗氧化物質(zhì)代謝(葛根糖苷、黃豆黃素、二氫玉米素等)幾個(gè)方面。綜上,通過(guò)對(duì)硫辛酸最適添加量以及其作用的代謝組學(xué)機(jī)制進(jìn)行分析,確定中華絨螯蟹幼蟹飼料中硫辛酸的最適添加量為1339.13-1574.09 mg/kg,代謝組學(xué)結(jié)果表明,硫辛酸的攝入顯著影響了中華絨螯蟹機(jī)體對(duì)脂肪酸和氨基酸的代謝,且顯著增加了飼料中抗氧化物質(zhì)的吸收和沉淀,提高了機(jī)體的抗氧化能力。3.不同脂肪飼料中添加硫辛酸對(duì)中華絨螯蟹生長(zhǎng)及生理的影響作為水產(chǎn)動(dòng)物飼料中的三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一,單位質(zhì)量的脂肪能夠?yàn)闄C(jī)體提供的能量是糖類和蛋白質(zhì)的兩倍,因此,若能夠高效的利用飼料中的脂肪為機(jī)體提供能量,是節(jié)約飼料蛋白,減少環(huán)境污染的重要手段之一。本部分研究評(píng)估了不同脂肪含量(7%和13%)的飼料中,硫辛酸的不同添加量(700和1400 mg/kg)對(duì)中華絨螯蟹幼蟹生長(zhǎng)表現(xiàn),體成分,抗氧化能力,肝胰腺脂質(zhì)分解代謝和脂肪酸組成的影響。8周后,結(jié)果顯示,在兩種飼料脂肪含量下,700和1400 mg/kg硫辛酸的攝入均能夠顯著的提高中華絨螯蟹幼蟹的增重和特定生長(zhǎng)率,且體總脂和肝胰腺總脂含量隨著硫辛酸添加劑量的升高而顯著增加;攝入13%飼料脂肪的蟹肝體比顯著高于攝入7%飼料脂肪的蟹肝體比。7%飼料脂肪含量下,肝胰腺es_TGL2和es_IL的表達(dá)量隨著硫辛酸添加量的增加而上升,CPT-1的表達(dá)量在各個(gè)處理組間無(wú)顯著差異;1400 mg/kg硫辛酸的添加顯著的改善了由于肝胰腺脂質(zhì)的大量堆積對(duì)機(jī)體造成的氧化損傷,此處理組具有較高的SOD和GSH-Px活力和較低的MDA含量;13%飼料脂肪含量中,由于肝胰腺中過(guò)量的脂肪蓄積,GSH-Px的活力被顯著抑制,但T-AOC隨著硫辛酸添加量的增加而升高。本部分研究結(jié)果表明,無(wú)論在哪種飼料脂肪含量下,硫辛酸的添加都能夠提高中華絨螯蟹幼蟹的生長(zhǎng)表現(xiàn),并能夠促進(jìn)肝胰腺脂質(zhì)的蓄積,同時(shí),硫辛酸能夠緩解由于肝胰腺脂質(zhì)的過(guò)量蓄積對(duì)機(jī)體造成的氧化損傷,改善中華絨螯蟹幼蟹的健康狀況。4.硫辛酸與脂肪源對(duì)中華絨螯蟹的交互影響及不同脂肪源下肝胰腺脂質(zhì)組學(xué)分析飼料脂肪營(yíng)養(yǎng)價(jià)值取決于脂肪的質(zhì)量,而脂肪的性質(zhì)取決于其脂肪酸成分,不同的脂肪酸組成和比例發(fā)揮不同的功能,因此,本部分研究?jī)?nèi)容以四種不同的植物油源,棕櫚油(棕櫚酸)、橄欖油(油酸)、紅花籽油(亞油酸)和紫蘇籽油(亞麻酸)為脂肪源,分別設(shè)置不添加或添加1400 mg/kg的硫辛酸,在8周養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)后,對(duì)中華絨螯蟹幼蟹生長(zhǎng)表現(xiàn)、體成分、抗氧化能力、脂質(zhì)分解代謝和肝胰腺的脂肪酸組成進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,中華絨螯蟹幼蟹的增重率、特定生長(zhǎng)率、肝體比和存活均未受到飼料脂肪源和硫辛酸的顯著影響。中華絨螯蟹水分、蛋白質(zhì)和灰分在各個(gè)處理組之間也均無(wú)顯著性差異,在橄欖油和紫蘇籽油處理組中,硫辛酸的添加顯著的降低了蟹體成分總脂的含量,在添加硫辛酸的四種油源處理組中,棕櫚油處理組中蟹體總脂含量顯著的高于其他三種油源處理組。紫蘇籽油處理組中,硫辛酸的添加對(duì)中華絨螯蟹肝胰腺抗氧化能力的影響最顯著,添加硫辛酸后,肝胰腺中SOD,GSH-Px,T-AOC的活力和GSH的含量均顯著的高于未添加硫辛酸組,同時(shí),MDA的含量也高于對(duì)照組,硫辛酸的添加對(duì)其他三種油源處理組中華絨螯蟹肝胰腺抗氧化能力均無(wú)顯著的影響。對(duì)甘油三酯分解基因表達(dá)分析,未添加硫辛酸的四種油源處理組中,紫蘇籽油中es_TGL2,es_IL,es_DGL,es_CPT-1的基因表達(dá)量均低于其他三種油源,es_IL和es_CPT-1在橄欖油處理組中具有最高的基因表達(dá);在棕櫚油處理組中,硫辛酸的添加顯著增加了es_TGL1的基因表達(dá)量,顯著降低了es_DGL的基因表達(dá)量,在橄欖油處理組中,硫辛酸的添加顯著的降低了es_TGL2和es_IL的基因表達(dá)量,在紫蘇籽油處理組中,硫辛酸的添加顯著的提高了es_IL和es_CPT1的基因表達(dá)量。飼料脂肪源顯著的影響了中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺花生四烯酸和DHA的含量,極顯著的影響了除EPA之外的主要脂肪酸含量,硫辛酸的添加顯著的影響了C14:0,C16:0,C20:5n3,C22:6n3的含量,極顯著的影響了C18:0,C18:1n9和C18:2n6的含量。飼料硫辛酸的添加顯著的影響了∑PUFA的含量,極顯著的影響了∑SAFA,∑MUFA和∑n-6的含量。目前為止,對(duì)于水生動(dòng)物攝入不同的脂肪源后,機(jī)體對(duì)于脂肪酸的分配和組裝的差別仍不清楚,因此,本部分采用新興的脂質(zhì)組學(xué)技術(shù),分析了中華絨螯蟹攝入四種不同飼料脂肪源后,肝胰腺中不同類型的脂質(zhì)中脂肪酸的裝配情況,整理分析了甘油三酯(TG),磷脂酰膽堿(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)的含量以及其脂肪酸的分配和百分含量。結(jié)果顯示,橄欖油處理組肝胰腺的TG含量最低,紫蘇籽油處理組中肝胰腺TG含量顯著高于其他處理組;棕櫚油和橄欖油處理組的PC含量無(wú)顯著差異,但均顯著高于紅花籽油處理組,紫蘇籽油處理組中PC含量顯著低于其他三種油源處理組;PE的含量隨著飼料主要脂肪酸飽和程度的增加而顯著的下降。在TG的sn-1,3和sn-2位置中,脂肪酸的保留情況與攝入的主要脂肪酸一致,但sn-2位的C18:2含量在紫蘇子油處理組最多;在TG的sn-1,3位,橄欖油處理組中多不飽和脂肪酸的含量顯著低于其他三個(gè)油源處理組,紅花籽油處理組中EPA和DHA的含量顯著的高于其他處理組。在PC的sn-1位不含有C18:3,sn-2位不含有C18:0,飽和脂肪酸主要存在于sn-1位,不飽和脂肪酸主要存在于sn-2位。PE的sn-1位不存在C20:4,C20:5和C22:6三種脂肪酸,sn-2位不存在C18:0,sn-1位中主要結(jié)合的是C16:0和C18:0兩種飽和脂肪酸,不飽和脂肪酸含量較少,而sn-2位主要結(jié)合的是C20:5和C22:6兩種高不飽和脂肪酸,C16:0的含量非常少,PE的sn-1位和sn-2位置中主要脂肪酸的保留情況與機(jī)體攝入的主要脂肪酸類型一致。綜上,不同飼料脂肪源下添加硫辛酸并未顯著的改善中華絨螯蟹幼蟹的生長(zhǎng),但是在特定脂肪源處理下,能夠提高機(jī)體的抗氧化能力;硫辛酸對(duì)機(jī)體甘油三酯分解代謝的影響與攝入的主要脂肪酸類型存在密切的關(guān)系,但硫辛酸的添加顯著的影響了肝胰腺脂肪酸的組成。不同飼料脂肪源攝入后,中華絨螯蟹肝胰腺中TG和PE對(duì)于攝入的主要脂肪酸的保留情況較好,PC和PE的sn-1位主要結(jié)合飽和脂肪酸,而sn-2位主要結(jié)合不飽和脂肪酸,且并不是所有類型的脂肪酸都會(huì)結(jié)合在PC和PE的sn-1和sn-2位置上,本部分內(nèi)容是甲殼動(dòng)物中第一篇關(guān)于脂質(zhì)組學(xué)的研究,豐富了甲殼動(dòng)物脂肪酸代謝的基礎(chǔ)知識(shí),也為今后的相關(guān)研究提供了新的參考。
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S917.4
【圖文】：

1994a; b)。存甘油三酯的動(dòng)員攝入的能量不能滿足其能量消耗的需求時(shí)，儲(chǔ)存的甘油三機(jī)體額外的能量需求，例如饑餓、繁殖和遷移等。短期的組織中甘油三酯的分解實(shí)現(xiàn)的，長(zhǎng)期的需求可能會(huì)通過(guò)肝肪來(lái)提供。調(diào)控機(jī)體甘油三酯水解的細(xì)胞內(nèi)水解酶主要有甘油三酯水解酶（adiposetriglyceridelipase,ATGL），激素sensitivelipase,HSL）和單酰甘油脂肪酶（monoacylglycero在它們的共同作用下，將甘油三酯水解成甘油和游離的脂途徑，后者進(jìn)行 β 氧化，釋放 ATP 供能，或者形成磷脂

圖 1-2. 脂質(zhì)分解調(diào)節(jié)機(jī)制的結(jié)構(gòu)模型 (Zimmermann et al., 2009)Figure 1-2. A proposed model for the molecular mechanisms regulating lipolysis肢動(dòng)物與甲殼動(dòng)物甘油三酯分解代謝節(jié)肢動(dòng)物脂肪水解模式因?yàn)榧讱?dòng)物是節(jié)肢動(dòng)物門的一個(gè)亞門，因此在對(duì)甲殼動(dòng)物甘油三酯分探究中，節(jié)肢動(dòng)物是一類非常具有參考意義的物種，因此，對(duì)節(jié)肢動(dòng)物的成員——昆蟲(chóng)甘油三酯分解代謝知識(shí)的梳理有助于為研究甲殼動(dòng)物提供寶貴的思路。昆蟲(chóng)對(duì)于脂類的消化吸收等過(guò)程與脊椎動(dòng)物非常類似，但又存在一些重

本文編號(hào)：2714387