【摘要】：大鯢是目前現(xiàn)存最大的兩棲類,但是由于過度開采,棲息地的喪失,環(huán)境的污染,野生大鯢數(shù)量急劇下降。大鯢生殖生物學(xué)研究對于人工繁育及大鯢資源保護(hù)具有重要意義。首先通過解剖學(xué)及組織學(xué)分析了大鯢雄性性腺發(fā)育,其次克隆大鯢UCHL1及ESR1基因、生物信息學(xué)分析了二者分子特性;最后通過RT-PCR和RT-qPCR及免疫組織化學(xué)方法研究了UCHL1及ESR1在性腺發(fā)育過程中的表達(dá)和定位,結(jié)果如下:1、解剖觀察發(fā)現(xiàn),6月齡大鯢性腺呈長條狀;12月齡到性成熟前,大鯢睪丸呈長橢圓形、卵巢呈扁平彎曲帶狀;初步確定大鯢性別分化的時間在6月齡到12月齡之間。H.E.染色結(jié)果,6月齡大鯢性腺有大核細(xì)胞形成的外壁,中央為單細(xì)胞構(gòu)成的網(wǎng)狀腔體;12月齡大鯢睪丸精小葉開始形成,間質(zhì)組織豐富;在2齡大鯢睪丸精小葉中生殖細(xì)胞和體細(xì)胞形成生精上皮,精小葉腔出現(xiàn);3齡大鯢睪丸精小葉數(shù)目增多,精小葉腔增大;成年大鯢在繁殖間期,睪丸精小葉中,各級生殖細(xì)胞有規(guī)律分布,且精小葉頂部出現(xiàn)成熟的精子;繁殖期的睪丸精小葉充滿成熟的精子。2、大鯢UCHL1基因全長1087bp,ORF有669 bp,編碼222個氨基酸;大鯢UCHL1蛋白有1個O-糖基化位點,14個磷酸化位點;大鯢UCHL1蛋白與人類UCHL1蛋白的同源性最高,達(dá)到73.99%。RT-qPCR結(jié)果顯示,隨著雄性性腺的發(fā)育,UCHL1 mRNA表達(dá)水平在2齡時達(dá)到峰值;進(jìn)一步檢測顯示繁殖期的UCHL1 mRNA表達(dá)顯著低于繁殖間期的水平。免疫組織化學(xué)表明,在6月齡大鯢性腺中,UCHL1表達(dá)于靠近性腺周邊的大細(xì)胞核中,隨著大鯢睪丸的發(fā)育,在12月齡大鯢睪丸中,UCHL1定位于精小葉包圍的細(xì)胞質(zhì);在2齡到3齡大鯢睪丸中,UCHL1定位于靠近小葉腔的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中,在成年大鯢睪丸中,UCHL1蛋白分布于精小葉腔內(nèi)的細(xì)胞之間。3、大鯢ESR1基因全長2585bp,ORF有1755bp,編碼584個氨基酸;大鯢ESR1蛋白有10個O-糖基化位點,3個N-糖基化位點,59個磷酸化位點;大鯢ESR1蛋白與日本大鯢的ESR1蛋白的同源性最高,達(dá)到99%,與哺乳動物同源性70%左右。RT-qPCR結(jié)果表明,從12月齡到3齡大鯢睪丸,ESR1mRNA表達(dá)呈上升趨勢。免疫組化結(jié)果顯示,在不同發(fā)育階段的大鯢睪丸中,ESR1蛋白均定位在睪丸生殖細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞,成年期的成熟精子沒有ESR1表達(dá)定位。以上結(jié)果表明,初步確定大鯢性別分化時間在6月齡到12月齡之間;在大鯢雄性性腺中,UCHL1有組成型表達(dá)(細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜定位)和分泌型表達(dá)(將生殖細(xì)胞分隔在不同微環(huán)境中),UCHL1可能與大鯢睪丸的發(fā)育有關(guān),保證生殖細(xì)胞同步發(fā)育;ESR1在脊椎動物中是高度保守的,在大鯢睪丸中,ESR1蛋白均定位于生殖細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞,可能參與維持大鯢生殖細(xì)胞的生存及正常的精子發(fā)生。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4
【圖文】：

（7）脫水：切片從 70%酒精、80%酒精、90%酒精到 100%酒精，每個浸泡 10 s，在純二甲苯溶液中浸泡 1 min；（8）封片：組織切片在通風(fēng)櫥中晾到半干后，用塑料吸管吸一小滴中性樹膠， 滴在組織的附近的切片上，平方蓋玻片，均勻壓片，組織要全部被樹膠覆蓋。2.2 實驗結(jié)果2.2.1 大鯢雌雄鑒別（1）解剖學(xué)研究對來源于陜西省漢中市寧強(qiáng)縣大鯢繁育場不同發(fā)育階段（6 月齡、12 月齡、2 齡、3齡）雌雄正常健康大鯢，進(jìn)行解剖，觀察大鯢性腺，6 月齡（30 條）、12 月齡大鯢（20條）在體視鏡下解剖，各發(fā)育階段大鯢及大鯢性腺解剖如圖 2-1。

2-1 D1、E1）體長約為 40cm 左右。在體視鏡下解剖 30 條 6 月齡大鯢，大鯢性腺解剖結(jié)果相似（圖 2-1 A2），均呈透明的長條狀；12 月齡及 2 齡大鯢性腺解剖圖，可以觀察到兩種不同的類型，睪丸和巢結(jié)構(gòu)差異明顯，12 月齡大鯢卵巢（圖 2-1 B2）主要呈扁平彎曲帶狀，而且像有木耳樣的邊，在體內(nèi)一般左右對稱，而 2 齡大鯢睪丸（圖 2-1C2）呈現(xiàn)出細(xì)長橢圓結(jié)構(gòu)，眼很難觀察到睪丸上的縱溝等結(jié)構(gòu)，但是在體視鏡下可以明顯地觀察到睪丸上的縱溝3 齡大鯢性腺解剖圖（圖 2-1D2，E2），可觀察到兩種類型性腺，3 齡大鯢睪丸（圖 2-1D形態(tài)穩(wěn)定，呈長橢圓形，前端比較尖，后端較鈍，且不在同一個水平面上，有顯著的溝，左右各 1 個，一般不是很對稱，位于體腔背部，構(gòu)成睪丸系膜連于背側(cè)的體壁，腎臟平行，睪丸上的縱溝則把睪丸分為兩葉；3 齡大鯢卵巢（圖 2-1E2）形態(tài)與 12 月齡2 齡大鯢卵巢形態(tài)類似，呈扁平帶狀，彎曲而且像有木耳一樣的邊，在體內(nèi)一般左右稱。此外，在兩側(cè)睪丸的前端可以清晰可見黃色月牙狀或指狀結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)為脂肪體（2-1D2）中黑色箭所示。（2）組織學(xué)分析

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2 劉進(jìn)輝,江輝,譚理琦,周玉林,李麗平;大鯢精巢的解剖及組織形態(tài)結(jié)構(gòu)研究[J];經(jīng)濟(jì)動物學(xué)報;2004年03期

3 何麗;陳再忠;;血鸚鵡的體型及生殖潛力評價[J];水產(chǎn)科技情報;2008年05期

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