【摘要】：雜色鮑是我國重要的海產養(yǎng)殖貝類,鮑魚養(yǎng)殖業(yè)在全球范圍內具有重要地位。由于雜色鮑的疾病多發(fā)造成了鮑的大規(guī)模死亡,因此研究雜色鮑的發(fā)育和免疫的機理至關重要。MyD88是經典信號通路—TLR信號通路中重要的一員,可以激活NF-κB和凋亡信號通路,在免疫機制上具有重要的作用。同時,MyD88是Toll-背腹分化通路中的重要一員,這對研究雜色鮑發(fā)育的機制具有重要的意義。在本實驗室獲得的雜色鮑轉錄組基礎上,采用RACE技術共成功克隆得到兩條骨髓樣分化因子序列分別命名為hdMyD88和hdMyD88-2。本實驗結合qPCR、RNAi和原位雜交技術研究雜色鮑MyD88在免疫和發(fā)育中的作用。主要的結果有:1)hdMyd88 cDNA全長為1927 bp,3’UTR為483bp,5’UTR為130 bp,開放閱讀框1314 bp,編碼438個氨基酸,距polyA 20 bp處有加尾信號。生物信息學分析表明其編碼蛋白,含有Myd88 DD結構域(215-460 bp)和TIR-2超家族結構域(665-1000 bp),DD結構域中包含有Myd88-IRAK4的相互作用位點。預測的蛋白分子量約48.92 kDa,等電點約5.63。不含信號肽,無二硫鍵,1個N糖基化位點,46個絲氨酸磷酸化位點,6個蘇氨酸,5個酪氨酸,無跨膜結構。hdMyd88-2 cDNA全長為1820 bp,3’UTR為580bp,5’UTR為190 bp,開放閱讀框1050 bp,編碼350個氨基酸,距polyA 15 bp處有加尾信號AATAA。含有Myd88 DD結構域(247-475 aa)和TIR 2超家族結構域(823-1228 bp)。預測的蛋白分子量約39.65 kDa,等電點約8.05。不含信號肽,無二硫鍵,4個N糖基化位點,14個絲氨酸磷酸化位點,7個蘇氨酸,2個酪氨酸,無跨膜結構。2)在胚胎和幼蟲發(fā)育過程中,hdMyD88從卵、2細胞、8細胞到桑葚胚時期表達量比較穩(wěn)定,而8細胞較2細胞相比呈顯著性上升(p0.05);從128細胞開始MyD88的表達量逐漸下降;從桑椹期直至面盤幼蟲晚期,MyD88的表達量都處于較低水平,并與8細胞和匍匐幼蟲早期存在極顯著差異(p0.01)。IRAK4在卵和2細胞時期表達量比較穩(wěn)定,8細胞期的表達量急劇上升,之后的表達量急劇下降,隨后的表達量較為穩(wěn)定。8細胞期的表達量與其他各時期呈顯著性差異(p0.05)。AP1在卵裂、胚胎發(fā)育階段以及幼蟲階段早期早期的表達量比較穩(wěn)定,從匍匐幼蟲早期后,表達量顯著性上升(p0.05)。TNFα的表達量從卵細胞到128細胞逐漸下降,但沒有顯著性差異(p0.05);隨后表達量逐漸上升,到匍匐幼蟲早期時,TNFα的表達量與二細胞和8細胞的表達量呈顯著性差異(p0.05)。CAT的表達量從卵細胞到面盤中期一直處于較為穩(wěn)定的狀態(tài),匍匐幼蟲早期的表達量顯著性上升(p0.05)。SOD的表達情況同CAT的較為相似,匍匐幼蟲早期與其他各時期的表達量相比呈顯著性上升(p0.05)。與MyD88不同的是,MyD88-2的表達量從卵細胞開始處于較低的表達水平,直到擔輪幼蟲期顯著性上升(p0.05),之后在面盤期下降,直至匍匐幼蟲早期表又顯著性上升(p0.05)。3)dsMyD88浸泡擔輪幼蟲后結果顯示:dsMyD88處理后對空白對照組、陰性對照組dsEGFP和dsMyD88實驗組的幼蟲存活率無顯著差異(P0.05)。結果顯示:基于不同的內參,dsMyD88組處理后的擔輪幼蟲的MyD88的表達量明顯下降,與空白組和陰性對照組存在顯著性差異(P0.05)。同時,對于Toll信號通路中Myd88的的下游基因IRAK4的表達量也明顯下降(P0.05);AP1的表達量顯著性上升(P0.05),TNFα的表達量極顯著性上升(P0.01),CAT的表達量也明顯下降(P0.05),而SOD的表達量不存在顯著性差異(P0.05)。對于MyD88,MyD88-2的表達量較空白組顯著性降低(P0.05)。dsMyd88浸泡面盤早期幼蟲后結果顯示;dsMyD88組處理后的面盤早期幼蟲的MyD88的表達量明顯下降,與空白組和陰性對照組存在極顯著性差異(P0.01)。同時,對于Toll信號通路中MyD88的的下游基因IRAK4的表達量空白組同干擾組表達量較明顯下降(P0.05),對于AP1和TNFα,AP1和TNFα的表達量都呈極顯著性上升(P0.01);CAT的表達量不存在也顯著性差異(P0.05),而SOD的表達量較其他兩組呈存在顯著性差異(P0.05);對于MyD88-2來說,各組之間都不存在顯著性差異。4)采用原位雜交的方法檢測dsMyD88處理擔輪幼體早期和面盤幼蟲6 h前后的樣品,顯示從擔輪幼體早期到面盤中期,MyD88特異性定位在腹側。RNAi干擾后,實驗組未檢測到陽性信號,而陰性對照組具有陽性信號。RNAi干擾后再用副溶血弧菌感染幼蟲,可以檢測到微弱的信號。5)優(yōu)化了培養(yǎng)雜色鮑原代細胞條件,并利用這些原代細胞進行了RNAi和外源基因表達。結果表明,較高的滲透壓對血淋巴細胞培養(yǎng)起重要作用,淋巴細胞分離液分離血淋巴細胞更利于其生長。原代細胞培養(yǎng)至5 d時,在細胞培養(yǎng)液中添加10μg/mL的MyD88dsRNA,能夠顯著降低MyD88 mRNA的表達。pEGFP-N1轉染培養(yǎng)5 d的鰓細胞,5 d后可以檢測到綠色熒光。以上結果表明,可以成功培養(yǎng)雜色鮑血、鰓原代細胞,并且這些原代細胞可以進行基因功能缺失或調高的研究,為功能基因注釋提供了便利條件。 【學位授予單位】：集美大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4

【圖文】：

集美大學碩士學位論文 雜色鮑 MyD88 在發(fā)育和免疫過程中的作用研究基酸和 表示疏水氨基酸殘基，圖 1.1[43]）。MyD88N 端編碼一個大約 90 個氨基酸的死亡結構域（DD），，最初發(fā)現(xiàn)這個結構域的作用是促凋亡蛋白；后來發(fā)現(xiàn)的一些含有 DD 結構域的蛋白質確沒有明顯的凋亡作用，這說明 DDs 似乎是一般蛋白相互結合為點的基序[44]。多數(shù)蛋白質中，DDs 通常位于非�？拷� 5 端，DD 通常折疊成含有 3 個 螺旋。這個 DD結構域通常與和 caspase 的招募結構域（CARD）和死亡效應結構域家族（DED）構成 DD超家族[45]。類似性地，TIR 結構域（殘基 155-296）和 DD（殘基 1-109）使 MyD88 作為接頭分子將信號在上下游之間傳遞，如 IRAK TLR/IL-1R。此外，MyD88 可以通過 TIR-TIR和 DD-DD 的相互作用[46, 47]。早期的報告指出，MyD88 基因的表達僅限于髓組織。隨后研究表明，MyD88 在非骨髓組織中也表達，表明 MyD88 存在著更廣泛的生物學功能[39]。

色鮑各組織總 RNA 瓊脂糖凝ectrophoresis of total RNA in tiss肌肉；2：外套膜；3：粘液腺；antle; 3, colleterial gland; 4, hep果NA 為模板，RACE 引物分 hdMyD88 3’ 端擴增產物，34 bp；圖 3-4 為雜色鮑 hdM

【參考文獻】

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本文編號：2711924