【摘要】：大黃魚(Larimichthys crocea),屬于硬骨魚綱鱸形目,是我國傳統(tǒng)的“四大海產”之一。隨著大黃魚人工養(yǎng)殖日益興起,高密度、集約化養(yǎng)殖模式加速了魚體微生物病癥的發(fā)生,出現(xiàn)了如魚體生長衰退、抗病能力弱、品質低等問題,嚴重影響并制約了大黃魚養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。鰻弧菌是養(yǎng)殖大黃魚出現(xiàn)弧菌病的主要病原菌之一,而溶菌酶是魚體內殺菌的關鍵酶,本文以大黃魚為研究對象,研究溶菌酶在大黃魚不同組織表達情況,并通過鰻弧菌侵染和ploy(I:C)處理,研究溶菌酶基因的脅迫反應,希望可以為以后大黃魚的免疫調節(jié)機制研究提供一定的理論支持。主要結論如下:通過大黃魚基因組數(shù)據(jù)庫獲得大黃魚兩種溶菌酶CDNA全長序列,并通過克隆測序進行驗證,c型溶菌酶CDNA全長為763bp,編碼110個氨基酸,其基因組數(shù)據(jù)庫登錄號為XM-010753143.1;g型溶菌酶CDNA全長為879bp,編碼193個氨基酸,其基因組數(shù)據(jù)庫登錄號為XM-010740410.1。魚類c型溶菌酶與哺乳動物的親緣關系較近,魚類g型溶菌酶同鳥類親緣關系較近。研究兩種溶菌酶基因在大黃魚脾臟、腎臟、肝臟、心臟、肌肉、鰓、腸、腦這8種組織表達特異性情況,表明c型溶菌酶在肝臟中的表達量最高,在心和腸中的表達量略高于其他組織;g型溶菌酶在腸和腎表達量最高,其次是腮和肝、脾。鰻弧菌侵染實驗證明:在肝臟、脾臟、腎臟組織中,c型溶菌酶的表達量比對照組低,但鰻弧菌侵染6h后,腎臟中c型溶菌酶表達顯著升高;g型溶菌酶的表達量呈先升高后降低趨勢,在肝臟中,鰻弧菌處理下g型溶菌酶在12h表達量達到峰值;ploy(I:C)處理下在24h表達量達到峰值。在脾臟中實驗組的表達量在36h達到峰值;在腎臟中,鰻弧菌和ploy(I:C)處理下g型溶菌酶分別在36h和48h表達量達到峰值。本文通過對大黃魚兩種溶菌酶基因的全長序列的生物信息學分析、組織特異性表達以及鰻弧菌侵染對上述兩種溶菌酶基因表達量的影響這三方面的研究得出:1、c型和g型溶菌酶基因的保守性較高;2、健康大黃魚中兩種基因都在腸的表達量高,但效果不同;3、受到細菌侵染后肝臟、腎臟、脾臟中c型溶菌酶基因表達量變化不大,推測該溶菌酶可能主要發(fā)揮消化作用;g型溶菌酶基因在肝臟、腎臟、脾臟中表達量都有顯著上調,只是最高表達量出現(xiàn)時間不同,說明g型溶菌酶參與了大黃魚的機體免疫。
【圖文】：

的氨基酸序列，它的網(wǎng)址為 http://ww件預測目的基因序列的等電點(pI)以及分rg/tools/protparam.html；使用 UCSC 在線進行搜索，它的在線網(wǎng)址為 http://geno酶 ORF 獲得及序列分析結果據(jù)庫中查到溶菌酶全長基因序列，通過序列，并進一步測序，通過同源性比對，閱讀框序列全長。實驗所用模板取自于腦條大黃魚腦組織中總 RNA 提取的電泳

2.4.1.2 大黃魚 c 型溶菌酶基因 ORF 的獲得在大黃魚全基因組數(shù)據(jù)庫中獲得 c 型溶菌酶序列全長，在 NCBI 上通過同源性比對發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白與其他魚類的溶菌酶序列具有相似的長度，其編碼的蛋白也具有相同的保守結構域。以此序列為依據(jù)設計引物，，進行 PCR 擴增并測序，測序結果與數(shù)據(jù)庫中一致。此基因在 GenBank 數(shù)據(jù)庫的登錄號為 XM-010753143.1。利用 ORFFinder 在線軟件對其開放閱讀框進行搜索，獲得的 c 型溶菌酶基因 CDNA 序列全長為 763bp，5’非編碼區(qū) 143 bp，3’非編碼區(qū)長度為 287 bp，開放閱讀框長度為 333 bp，可編碼 110 個氨基酸。在線預測的 c 型溶菌酶多肽的相對分子質量(MW)約為27.68kDa，理論等電點(pI )為 5.24。開放閱讀框具有八個保守的 Cys(半胱氨酸)，可形成 Cys4-Cys108，Cys12-Cys96，Cys46-Cys61，Cys57-Cys92 共四對二硫鍵。大黃魚 c型溶菌酶有 2 個保守的催化殘基位點 Glu(E17)和 Asp(D34)。
【學位授予單位】：浙江海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S943

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本文編號：2711580