【摘要】：近年來集約化養(yǎng)殖模式不斷推廣,水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)得以迅速發(fā)展,同時(shí)也面臨著許多因養(yǎng)殖密度過高、飼料投喂頻繁、藥物濫用等帶來的環(huán)境問題,養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物也面臨多種環(huán)境因子的脅迫。而作為水環(huán)境中一項(xiàng)重要的影響因子,pH突變會(huì)對(duì)蝦體的酸堿平衡和滲透調(diào)節(jié)等功能造成脅迫,降低蝦體的免疫能力,繼而抑制其生長(zhǎng)。為研究鈉氫交換體(Na~+/H~+-exchanger,NHE)和碳酸酐酶(Carbonic Anhydrase,CA)在中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)響應(yīng)pH脅迫過程中發(fā)揮的作用,首先采用靜水毒性實(shí)驗(yàn)方法確定了中國(guó)對(duì)蝦72 h酸堿半致死pH,然后利用RACE技術(shù)克隆了中國(guó)對(duì)蝦鈉氫交換體(Na~+/H~+-exchanger isoform 3)、細(xì)胞質(zhì)碳酸酐酶(cytoplasmic Carbonic Anydrase)和糖基磷脂酰肌醇碳酸酐酶(glycosyl-phosphatidylinositol-linked Carbonic Anhydrase),并通過熒光定量PCR及RNA干擾技術(shù)分析了其在pH脅迫下的表達(dá)特征及功能,通過原位雜交觀察脅迫前后三種基因在對(duì)蝦鰓組織中的分布差異,以期了解NHE3和CA在中國(guó)對(duì)蝦適應(yīng)pH脅迫中的作用機(jī)制,并為研究甲殼動(dòng)物酸堿水環(huán)境適應(yīng)機(jī)制提供理論依據(jù)。1.實(shí)驗(yàn)對(duì)中國(guó)對(duì)蝦在不同pH梯度脅迫下的死亡率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析,發(fā)現(xiàn)pH為4.6和9.7時(shí),72 h累計(jì)死亡率達(dá)到100%,pH為6.6和8.1時(shí)近乎沒有出現(xiàn)死亡個(gè)體,通過寇氏法分別計(jì)算出中國(guó)對(duì)蝦酸性半致死pH值及堿性半致死pH分別為5.2和9.1;取不同pH脅迫下的對(duì)蝦鰓組織,做HE染色處理,結(jié)果顯示堿性半致死pH(pH 9.1)脅迫下對(duì)蝦鰓組織損傷較對(duì)照組和酸性半致死pH(pH 5.2)脅迫組嚴(yán)重,出現(xiàn)明顯的鰓絲腫大,血細(xì)胞腫脹等現(xiàn)象。2.克隆獲得中國(guó)對(duì)蝦鈉氫離子交換體(Na~+/H~+-exchanger isoform 3)基因,命名為FcNHE3,該基因cDNA序列全長(zhǎng)3508 bp,開放閱讀框2805 bp,編碼934個(gè)氨基酸,具有信號(hào)肽和12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域;蛋白同源分析發(fā)現(xiàn),FcNHE3與青蟹(Carcinus maenas)同源性最高,達(dá)到74%;系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,FcNHE3與三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)和青蟹(Carcinus maenas)親緣關(guān)系最近。熒光定量PCR分析表明,FcNHE3基因在鰓組織中表達(dá)量顯著高于其他組織(P0.05);酸性半致死pH(pH 5.2)脅迫下,FcNHE3基因在整個(gè)脅迫過程中顯著上調(diào)表達(dá)(P0.05);堿性半致死pH(pH 9.1)脅迫下,FcNHE3基因在前48 h顯著下調(diào)表達(dá)(P0.05),12 h表達(dá)量最低,僅在72 h出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。原位雜交結(jié)果顯示,酸性半致死pH(pH 5.2)脅迫組雜交信號(hào)較堿性半致死pH脅迫(pH 9.1)組和對(duì)照組都強(qiáng),說明了在酸性半致死pH脅迫下FcNHE3基因表達(dá)較高,與pH脅迫24 h后qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。RNA干擾結(jié)果顯示,注射siRNA后,FcNHE3基因表達(dá)受到抑制,pH 5.2脅迫下對(duì)蝦存活率相比對(duì)照組顯著下降。當(dāng)FcNHE3基因被干擾3h后si-3組干擾效率最高,該時(shí)間點(diǎn)FcCAc、FcCAg、V-H~+-ATPase(VHA)和Na~+/HCO_3~-cotransporter(NBC)與對(duì)照組相比表達(dá)均下調(diào),HCO_3~-cotransporter(AE)、Na~+/K~+/Cl~-cotransporter(NKCC)基因表達(dá)相對(duì)上調(diào)。研究表明FcNHE3在中國(guó)對(duì)蝦響應(yīng)pH脅迫過程中尤其在酸性水環(huán)境中可能發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。3.克隆獲得中國(guó)對(duì)蝦兩種碳酸酐酶基因,分別為細(xì)胞質(zhì)碳酸酐酶(cytoplasmic Carbonic Anydrase),命名為FcCAc和中國(guó)對(duì)蝦糖基磷脂酰肌醇碳酸酐酶(glycosyl-phosphatidylinositol-linked Carbonic Anhydrase),命名為FcCAg,系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,兩種基因均與凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)親緣關(guān)系最近。組織表達(dá)分布結(jié)果顯示,兩種基因表達(dá)量均在鰓組織中最高;在酸性半致死pH(pH5.2)脅迫下,FcCAc基因表達(dá)呈波浪式變化,先升高后降低,72 h基本恢復(fù)至對(duì)照組水平(P0.05);在堿性半致死pH(pH 9.1)脅迫下,0-24 h一直處于下調(diào)表達(dá),且24 h處表達(dá)量最低,而后表達(dá)量回升,72 h上調(diào)表達(dá)(P0.05);對(duì)于FcCAg基因,在酸性半致死pH(pH 5.2)脅迫下,基因在整個(gè)過程中大致處于顯著上調(diào)表達(dá),在12 h處表達(dá)量最高(P0.05);在在堿性半致死pH(pH 9.1)脅迫下,前24 h基因一直處于顯著下調(diào)表達(dá),而24 h后表達(dá)水平回升,到72 h達(dá)到上調(diào)表達(dá)。對(duì)酸堿脅迫24h的樣品進(jìn)行原位雜交檢測(cè),結(jié)果顯示相較于對(duì)照組,FcCAc在酸性半致死pH(pH 5.2)和堿性半致死pH脅迫(pH 9.1)組雜交信號(hào)均較弱,說明了在pH脅迫下24 h FcCAc基因表達(dá)有所降低;FcCAg在酸性半致死pH脅迫組雜交信號(hào)較堿性半致死pH脅迫組和對(duì)照組都強(qiáng),而堿性半致死pH脅迫組雜交信號(hào)最弱,說明了在低pH脅迫下FcCAg基因表達(dá)較高;與脅迫實(shí)驗(yàn)中24 h基因表達(dá)量情況相符合。RNA干擾后,FcCAc和FcCAg均受到抑制,pH 5.2脅迫下對(duì)蝦存活率相比對(duì)照組顯著下降。當(dāng)FcCAc被干擾3 h后si-3組干擾效率最高,該時(shí)間點(diǎn)離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因FcNHE3、FcCAg、FcVHA和FcAE基因表達(dá)相對(duì)下調(diào),而FcNBC和FcNKCC基因表達(dá)相對(duì)上調(diào);當(dāng)FcCAg基因被干擾3 h后si-1組干擾效率最高,該時(shí)間點(diǎn),所選取離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因均表達(dá)下調(diào)。說明該兩種基因可能通過與其他離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因相互作用共同在中國(guó)對(duì)蝦響應(yīng)pH脅迫中發(fā)揮重要功能。
【圖文】：

甲殼動(dòng)物鰓離子轉(zhuǎn)運(yùn)上皮細(xì)胞離子轉(zhuǎn)運(yùn)過程模式圖（仿eneralised model for ion transport of branchial epithelium換體(Na+/H+-exchanger, NHE)體（Na+/H+-exchanger, NHE），是機(jī)體維持酸堿平衡要的膜蛋白，其中 NHE1 在調(diào)控細(xì)胞內(nèi) pH 值和細(xì)胞體過增加細(xì)胞內(nèi) pH 值從而影響細(xì)胞分裂[34]。目前已有HE-10）被確認(rèn)，普遍存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的 NHE-1 在若其被過分激活，NHE1 將參與形成心律失常、心絞痛程，NHE-1 抑制劑可以特異性地作用于缺血區(qū)域，避免細(xì)胞內(nèi)進(jìn)入過多 Na+，從而降低 Na+/Ca+交換量，胞攣縮、壞死發(fā)生，在減輕心肌損傷、避免壞死方面有 NHE 的研究主要集中在調(diào)控腫瘤細(xì)胞內(nèi)外酸堿平衡方內(nèi)偏堿性，，細(xì)胞外偏酸性，而腫瘤細(xì)胞內(nèi)也是堿性狀能促進(jìn)其生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移[35]；有研究發(fā)現(xiàn)若通過抑制內(nèi)外 pH 值發(fā)生變化，則可達(dá)到限制生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的目的[3

3h5.61±0.05 5.48±0.05 7.39±0.05 8.37±0.05 8.49±0.056h6.04±0.05 5.85±0.05 7.42±0.05 7.69±0.05 7.75±0.0512h6.32±0.05 6.00±0.05 7.45±0.05 7.60±0.05 7.65±0.05表 1-3 0-72 h 對(duì)蝦血淋巴 pH 變化Table. 1-3 pH of blood during 0-72 ha b c1h5.48±0.05 5.72±0.05 5.79±0.053h5.56±0.05 5.70±0.05 5.57±0.056h5.49±0.05 5.43±0.05 5.60±0.0512h5.71±0.10 5.65±0.10 6.02±0.1024h5.77±0.10 6.00±0.05 5.74±0.1048h5.68±0.10 5.94±0.10 5.90±0.1072h5.71±0.10 5.80±0.05 5.88±0.05
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 于天基;李健;李吉濤;孫銘;任海;梁忠秀;;pH脅迫對(duì)脊尾白蝦抗氧化酶活力的影響[J];海洋科學(xué);2015年05期

2 李玉全;;pH脅迫對(duì)脊尾白蝦代謝酶活力的影響[J];南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2014年06期

3 王蕓;李健;張U

本文編號(hào)：2711400