【摘要】：WT1(Wilms’tumor suppressor gene 1)是一種編碼鋅指蛋白的轉錄因子,對哺乳動物泌尿生殖系統(tǒng)的發(fā)育有重要作用,哺乳類WT1基因突變會導致腎、性腺和脾等器官缺陷。在斑馬魚(Danio rerio)中存在兩個WT1同源基因,分別命名為wt1a和wt1b。本實驗采用CRISPR/Cas9技術在斑馬魚中分別敲除wt1a和wt1b來研究其對斑馬魚胚胎發(fā)育的作用。純合的wt1a~(-/-)突變體后代表現(xiàn)出生長發(fā)育畸形,出現(xiàn)心包積液、卵黃囊水腫同時腎小球的發(fā)育也會受損;純合的wt1b~(-/-)突變體表型正常、能正常存活,沒有觀察到類似于敲降wt1b時所出現(xiàn)的表型。足細胞是機體形成腎小球濾過屏障的重要部分,其缺失能引發(fā)多種腎臟相關的疾病。為進一步驗證wt1a~(-/-)突變體發(fā)育畸形是否與腎臟足細胞發(fā)育相關,我們選取了足細胞標記基因podocin和nephrin,通過二者的表達量變化可知wt1a的缺失會阻斷足細胞的分化并抑制podocin和nephrin的表達。然而podocin和nephrin在wt1b~(-/-)突變體中能正常表達。因此,wt1a在斑馬魚腎臟發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用而wt1b可能不是腎臟發(fā)育所必須的基因。細胞自噬(autophagy)是真核細胞中一種普遍而又重要的生命現(xiàn)象,在維持細胞穩(wěn)態(tài)和細胞生命活動等方面起重要作用,自噬異常與細胞生長發(fā)育及多種疾病密切相關。檢測發(fā)現(xiàn)在wt1a~(-/-)突變體中自噬水平明顯降低,為進一步研究自噬、wt1a在足細胞發(fā)育中的功能,我們選取自噬激活藥物雷帕霉素處理斑馬魚胚胎一段時間后檢測足細胞標記基因的表達水平,發(fā)現(xiàn)足細胞的損傷得到了部分改善。綜上所述,我們的實驗確認了wt1a是斑馬魚腎臟發(fā)育所必須的基因,并且為建立魚類足細胞損傷的研究模型提供了一條思路。
【圖文】：

遠端早期（distal early, DE）和遠端晚期（distal late, DL）、腎小球（glomerulus, G）、頸部（neck, N）、斯坦尼氏小體（corpuscle of Stannius, CS）和前腎導管（pronephricduct,PD）。每個節(jié)段都能表達特定相關的基因，通過這些 maker 基因可對不同節(jié)段進行區(qū)分。隨著機體發(fā)育至 48hpf，各個節(jié)段的腎管隨著機體細胞遷移完成前腎組織形態(tài)的發(fā)育，兩側的腎小球彼此靠攏并在尾部泄殖腔處融合，啟動血液濾過，形成有功能的前腎（Wingert et al 2007; Wingert and Davidson 2008）。隨著斑馬魚從胚胎到幼魚的蛻變，大約 10dpf 開始投喂，這一發(fā)育過程中伴隨著鱗和鰭的產生，臟器、神經系統(tǒng)的重塑（Parichy et al 2009）。大約是為適應更高的滲透壓環(huán)境斑馬魚的中腎腎單位在受精后 12-14dpf 開始形成，早期中腎的發(fā)生包括在尾部的腎祖細胞的初現(xiàn)，這些細胞聚集成簇，，上皮細胞變成腎小泡狀體，延伸至新的腎單位并與之融合，促進中腎形成，而前腎隨之在 30-60dpf 退化（Zhou et al 2010; Diep et al 2011;Diep et al 2015）。中腎發(fā)育成熟后隨著機體的不斷發(fā)育會伴隨著新的腎單位產生以適應體重變化和損傷修復的需要（Zhou et al 2010）。

圖 3-1 斑馬魚成魚各組織 RNA 的提取結果 The results of RNA extraction from various tissues of zlot 檢測 wt1a 和 wt1b 在各組織中的表達鼠的 WT1 抗體（Anti-Wilms Tumor Protein ant在斑馬魚各組織中的表達情況，選用 β-actin 作為 45KD。由圖 3-2 可知 WT1 主要在斑馬魚的
【學位授予單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

相關期刊論文 前6條

1 于力;葛林;;腎小球足細胞自噬與PI3K/Akt信號通路的研究進展[J];臨床兒科雜志;2015年06期

2 王朋輝;;斑馬魚腎臟發(fā)育研究進展[J];安徽農業(yè)科學;2013年08期

3 李輝輝;黃萍;董巍;朱作言;劉東;;斑馬魚研究走向生物醫(yī)學[J];遺傳;2013年04期

4 賈順姬;孟安明;;中國斑馬魚研究發(fā)展歷程及現(xiàn)狀[J];遺傳;2012年09期

5 魏凱;顧樂怡;;細胞自噬及其在腎臟疾病中的作用[J];中國中西醫(yī)結合腎病雜志;2012年05期

6 孫智慧;賈順姬;孟安明;;斑馬魚:在生命科學中暢游[J];生命科學;2006年05期

相關博士學位論文 前4條

1 祁冰雪;DYYG化合物誘導足細胞自噬對PAN腎病的腎臟保護作用[D];吉林大學;2017年

2 丁大法;Db/db小鼠腎臟足細胞自噬與凋亡變化及白藜蘆醇干預影響及機制研究[D];南京醫(yī)科大學;2017年

3 王叢叢;ATF6在內質網應激引起的HepG2細胞自噬與凋亡中作用機制的研究[D];中國農業(yè)大學;2014年

4 王倩;斑馬魚抗寒模型的構建及魚類相關基因功能探討[D];中國科學院研究生院（海洋研究所）;2014年

相關碩士學位論文 前2條

1 朱世誠;斑馬魚前腎突變體的遺傳篩選及其機制研究[D];西南大學;2016年

2 王文琰;自噬早期激活可抑制醛固酮誘導的足細胞損傷[D];南京醫(yī)科大學;2012年

本文編號：2711065