【摘要】：乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是由一群形態(tài)、代謝和生理特性相似,發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的革蘭氏陽性細菌的統(tǒng)稱。由于這些細菌能產(chǎn)生乳酸、蛋白酶、脂肪酶、抗菌肽等眾多胞外分泌物,刺激動物的免疫系統(tǒng)并提高免疫能力;同時,能定植在機體腸道內,提高機體消化吸收能力和新陳代謝能力。因此,LAB是世界公認的重要益生菌并被已廣泛應用。本研究采用MRS培養(yǎng)基溶鈣圈方法,從試驗室保藏的113株熱帶海洋環(huán)境菌株和從海水養(yǎng)殖環(huán)境樣品與凡納濱對蝦消化道分離的110株細菌中,共篩選獲得具有產(chǎn)乳酸活性的細菌40株;經(jīng)革蘭氏染色和16SrDNA序列分析,這些細菌為革蘭氏陽性菌,包括乳酸乳球菌(Lactococus lactis)13株、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)12 株、海氏腸球菌(Enterococcus hirae) 5 株、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)2 株、屎腸球菌(Enterococcus faecium) 2 株、巴黎鏈球菌(EptococcuslutetiensiStrs)2 株、耐久腸球菌(Enterococcus durans)1株、嬰兒鏈珠菌(Streptococcus infantarius)1 株、馬腸球菌(Streptococcus equinus)株、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)1株;通過測定所有菌株的溶血活性,結果表明,乳酸乳球菌、糞腸球菌、海氏腸球菌和發(fā)酵乳桿菌共32株菌為γ溶血(無溶血活性);分別選取產(chǎn)酸能力最強的乳酸乳球菌和糞腸球菌各2株(S1、S2、F3、F7),測定其胃腸液耐受性、疏水率、自凝集率、對病原拮抗作用,并開展安全性評價試驗。結果表明,這4株菌可適應對蝦消化道環(huán)境,對哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus sakazaki)和無乳鏈球菌、愛德華氏菌(Edwardsiella)等病原具有較強的拮抗作用,且對凡納濱對蝦無毒無害。通過拌料投喂試驗,測定S1、S2、F3、F7對凡納濱對蝦的餌料系數(shù)、特定生長率、增重率、成活率和弧菌脅迫死亡率的影響。結果顯示:當S1、S2、F3、F7的拌料濃度為108cfu/g(對蝦初始體重0.63±0.15g)時,與對照組(市售復合乳酸菌試驗組作陽性對照,0.9%生理鹽水試驗組為陰性對照)相比,S1、S2、F3、F7對凡納濱對蝦的餌料系數(shù)、增重率、特定生長率、成活率和弧菌脅迫死亡率的影響均具有差異。其中,試驗組的餌料系數(shù)在0.868～0.890之間,陽性對照組為0.922,都低于陰性對照組(P0.05) ; S2組的成活率明顯高于陰性對照組(P0.05);所有組增重率在614.28%～768.67%之間,其中所有試驗組均高于對照組,S1組的最高,陰性對照組的最低;試驗組特定生長率為6.55%～7.20%之間,均與陰性對照組(6.55%)存在顯著性差異。根據(jù)“成活率優(yōu)先且增重率突出”的篩選原則,S2和F7可能是最適于凡納濱對蝦拌料投喂的菌株。當分別用S2和F7的3個濃度梯度(低濃度組106 cfu/g、中濃度組107 cfu/g、高濃度組108cfu/g)進行拌料投喂(對蝦初始體重0.73±0.20g)時,結果顯示,餌料系數(shù)、成活率、增重率、特定生長率和弧菌脅迫死亡率與陰性對照具有顯著性差異(P0.05)。其中,試驗組餌料系數(shù)在0.845-0.937之間,S2高濃度組餌料系數(shù)最低(0.845),陰性對照組最高(1.010);試驗組成活率在80.57%～85%之間,S2低濃度組最高(85%),陰性對照組最低(76.67%);試驗組增重率1914.25%～2306.37%之間,F7低濃度組最高(2306.37%),陰性對照組最低(1665.11%);試驗組特定生長率在4.91%～5.28%之間,F7低濃度組最高(5.28%),陰性對照組的最低(4.77%)。因此,與現(xiàn)有市售某復合菌株產(chǎn)品(當前最常用的拌料復合菌產(chǎn)品)相比,從海南熱帶海洋分離的土著乳酸菌更適于海南養(yǎng)殖凡納濱對蝦的拌料投喂。本研究采用單因素試驗法和采用響應面法相結合,優(yōu)化了 S2和F7的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基。其中,單因素試驗結果表明,S2和F7菌株最適發(fā)酵條件為pH 6.0～7.0、30～37℃、160～180r/min、裝液量45%～50%、接種量8%～10%。響應面試驗結果表明,S2最優(yōu)培養(yǎng)基為糖蜜87.40 g/L、NaCl 23.90 g/L,在30℃、通氣量為1 L/min、培養(yǎng)24h時,活菌數(shù)可達1.06×10~9cfu/mL; F7最優(yōu)培養(yǎng)基為酵母粉91.95g/L,胰蛋白胨83.91 g/L,在30℃、通氣量1 L/min、培養(yǎng)24h時,活菌數(shù)為1.12×1010cfu/mL。綜上所述,本研究從海南熱帶海洋環(huán)境的223株土著菌株中篩選并獲得了 2株適于養(yǎng)殖凡納濱對蝦拌料投喂的乳酸菌,確定了這2株細菌的最優(yōu)培養(yǎng)基和最適發(fā)酵條件,為今后開發(fā)適用于凡納濱對蝦養(yǎng)殖的熱帶土著乳酸菌制劑奠定了重要基礎,具有重要的意義!
【圖文】：

１．２．５乳酸菌的益生作用機制圖示逡逑乳酸菌在增強機體免疫能力、改善腸道微生物、抑制致病菌生長、促進機體生長逡逑等方面都具有巨大作用（圖１－１）。逡逑邐？改善健康和提高生長性能邋邐保持微生物區(qū)系平衡逡逑／Ｉ逡逑提供更多營養(yǎng)素邋＼邐？邐／逡逑＼邋—邐與病源菌競爭；逡逑［內源營養(yǎng)素Ｉ邐／逡逑ｘｒ－Ｘ逡逑乳酸菌邐＼逡逑＜—１產(chǎn)生乳酸邐／／邋＼邐＼邋｜促進消化邐Ｘ逡逑＜—合成維生素ｙｙ邐Ｉ邐抑制病源菌生長逡逑抗原邋Ｖ邋｜產(chǎn)生抗菌素ｔ邋｜產(chǎn)生有機酸逡逑＼邐邐Ｉ邐＾邐降低ｐＨ值逡逑——［提高免疫力邐［中和腸毒素邋ｊ邐逡逑圖１－１乳酸菌對于腸道和健康的主要影響逡逑Ｆｉｇ．１－１邋Ｌａｃｔｉｃ邋ａｃｉｄ邋ｂａｃｔｅｒｉａ＇ｓ邋ｍａｉｎ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｎ邋ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ邋ａ

65rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹
【學位授予單位】：海南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S968.22

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本文編號：2709742