【摘要】：性類固醇激素在硬骨魚(yú)的性別分化、繁殖和生長(zhǎng)等過(guò)程中都扮演著極其重要的角色,特別是雌激素在性別分化和性成熟過(guò)程中起決定性作用。而P450c17和20β-HSD在合成魚(yú)類性類固醇激素和孕激素的過(guò)程中不可或缺。本研究通過(guò)RT-PCR及RACE方法,從三峽庫(kù)區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚(yú)類——黃顙魚(yú)中克隆了P450c17和20β-HSD的復(fù)制基因:P450c17α-II和20β-HSD-I的部分c DNA序列。序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),P450c17α-II和20β-HSD-I片段長(zhǎng)度分別為1203bp和1198bp。多重序列對(duì)比顯示,黃顙魚(yú)P450c17α-I、-II均具有P450c17保守的Ono序列、十三肽和血紅素結(jié)合區(qū)域。20β-HSD-I、II均具有20β-HSD保守的輔酶結(jié)合區(qū)域、輔酶腺苷酸接合位點(diǎn)、穩(wěn)定β-折疊的結(jié)構(gòu)、部分激活位點(diǎn)、底物接合位點(diǎn)、催化部位和酰胺煙酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)。相似性分析表明,黃顙魚(yú)P450c17α-I、-II均與同為鲇形目的斑點(diǎn)叉尾洶和南方鯰相似性最高,與四足類相似性較低。20β-HSD-I、-II與斑點(diǎn)叉尾洶和革胡子鯰相似性最高,與四足類相似性較低。隨后,本研究還對(duì)上述基因的表達(dá)模式進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,黃顙魚(yú)P450c17α-I、-II在精巢和卵巢中均有表達(dá),且P450c17α-II在頭腎中也有表達(dá);而20β-HSD-I、-II呈現(xiàn)的是泛表達(dá)模式,在多種組織均有表達(dá)。季節(jié)表達(dá)模式研究結(jié)果表明,黃顙魚(yú)雄魚(yú)和雌魚(yú)P450c17α-I在1月表達(dá)量最;20β-HSD-I在11月表達(dá)量最;而P450c17α-II、20β-HSD-II在5月表達(dá)最高。隨著現(xiàn)代人類日�；顒�(dòng)的日益頻繁,內(nèi)分泌干擾物帶給人類和動(dòng)物健康的影響也越來(lái)越大,關(guān)注度也隨之增加。其中,對(duì)具有類雌激素效應(yīng)藥物的研究已逐漸成為熱點(diǎn)。本研究用類雌激素——乙炔基雌二醇(EE2,100ng/L)對(duì)黃顙魚(yú)(全雄)進(jìn)行暴露處理(7、14和28天)。處理結(jié)束后,用組織學(xué)和半定量RT-PCR(Semi-quantitative RT-PCR)研究了EE2對(duì)黃顙魚(yú)雄魚(yú)性腺發(fā)育和精子發(fā)生的影響,及P450c17α-I、-II和20β-HSD-I、-II m RNA的表達(dá)變化,所得結(jié)果和結(jié)論如下:EE2暴露處理后黃顙魚(yú)的精巢受到嚴(yán)重影響(暴露后14、28天),表現(xiàn)為性腺發(fā)育和精子發(fā)生延遲、停止,并出現(xiàn)生殖細(xì)胞大量減少,體細(xì)胞明顯增生的現(xiàn)象。基因表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn),EE2處理后P450c17α-I,-II和20β-HSD-I的表達(dá)均被明顯抑制,且呈時(shí)間依賴性;而20β-HSD-II表達(dá)無(wú)明顯變化。
【圖文】：

重慶師范大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 緒論羥化酶活性和 17，，20 裂解酶活性的 P450c17-I 和僅具有 17α-羥化酶活性的P450c17-II。P450c17-I cDNA 已經(jīng)在許多的硬骨魚(yú)類中被克隆和鑒定，其中包括青溕[53]，虹鱒[54]，革胡子鯰(Clarias gariepinus)[55]，斑點(diǎn)叉尾洶（Ictalurus punctatus）[56]，胖頭kr(Pimephales promelas)[57]和斑馬魚(yú)(Danio rerio)[58]等。而 P450c17-II 則僅在部分硬骨魚(yú)類中發(fā)現(xiàn)。細(xì)胞色素 P450c17 是脊椎動(dòng)物內(nèi)類固醇激素生成途徑中最為關(guān)鍵的酶類之一。它是一種微粒體酶, 具有兩種活性(17α-羥化酶、17，20-裂解酶)[59,60]，并在性腺類固醇激素的合成(雄激素合成的限速酶和雌激素)中起重要作用。它主要催化的兩個(gè)反應(yīng)分別是：C21 類固醇激素（孕酮）C17 位羥基化，17α-羥基孕酮濃度上升，促使腎上腺皮質(zhì)激素的合成，并參與合成卵巢中相關(guān)性腺類固醇激素（E2）的前體物質(zhì)；C21-類固醇上 17-20 碳鍵斷裂，產(chǎn)生 C19 性腺類固醇激素合成的前體物質(zhì)：脫氫表雄酮和雄烯二酮[61]（圖 1-3）。

士學(xué)位論文 2 黃顙魚(yú)兩種類固醇合成酶復(fù)制基因 cDNA 的克隆10gct：5gaOH 調(diào) pH 值到 7.0，加蒸餾水定容至 1L，高壓滅菌（121o霉素儲(chǔ)備液：將 1g 氨芐青霉素溶于蒸餾水定容到 10mL 配成菌，于-20°C 保存。使用時(shí)稀釋為 100μg/ml。備液：20mgX-gal 溶于 1ml 二甲基甲酰胺中，避光儲(chǔ)存于取 2g IPTG 溶于 8ml 蒸餾水中，定容至 I0ml，用 0.22μM 的菌，分裝成 lml 每份的儲(chǔ)備液，貯存于-20°C。菌株：質(zhì)粒 pMD19-T 的物理圖譜如圖 1.2，DH5α 感受態(tài)細(xì)。
【學(xué)位授予單位】：重慶師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S917.4

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本文編號(hào)：2708251