【摘要】：魁蚶是一種高蛋白、低脂肪的水產(chǎn)品,具有良好的市場前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。與其他軟體動(dòng)物一樣,魁蚶也主要依靠非特異性免疫因子進(jìn)行免疫防御活動(dòng),同時(shí)魁蚶又具有其特殊性,即其血淋巴中含有紅細(xì)胞,而且紅細(xì)胞已被證明不僅具有運(yùn)輸氧氣的功能而且還能夠發(fā)揮免疫作用。目前,魁蚶免疫相關(guān)基因的報(bào)道不多,只有錳超氧化物歧化酶、鐵蛋白、半乳糖凝集素、大防御素等少數(shù)幾個(gè)基因。因此深入開展魁蚶免疫因子的相關(guān)研究,對(duì)于豐富魁蚶免疫學(xué)資料具有重要意義。本文采用RT-PCR和cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆出魁蚶過氧化氫酶(SbCAT)、魁蚶髓樣分化因子88(SbMyD88)和魁蚶谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(SbGSTμ)基因的cDNA全長序列,并對(duì)它們進(jìn)行了一定的功能初步分析。SbMyD88基因全長為1564 bp,包括1326 bp的ORF(open reading frame),編碼442個(gè)氨基酸,預(yù)測分子量為50.2 kDa,理論等電點(diǎn)為5.32。SbMyD88氨基酸序列具有MyD88家族典型的死亡結(jié)構(gòu)域和TIR結(jié)構(gòu)域,在TIR結(jié)構(gòu)域中含有3個(gè)高度保守區(qū),即box1、box2和box3。同源性分析顯示,SbMyD88氨基酸與其它所選軟體動(dòng)物的氨基酸具有較高的相似性,其相似度為47%-61%。SbMyD88在系統(tǒng)進(jìn)化樹中,先和貝類的MyD88聚為一支,后和脊椎動(dòng)物聚在一起。qRT-PCR(quantitative real-time PCR)檢測發(fā)現(xiàn),SbMyD88基因在魁蚶各組織器官中均有表達(dá),其中在肝胰腺中表達(dá)量最低,在鰓中的表達(dá)量最高,為肝胰腺的348.72倍。經(jīng)鰻弧菌和金黃色葡萄球菌刺激后,SbMyD88在各個(gè)組織均表現(xiàn)出先上升再下降的趨勢。SbCAT基因全長為2181 bp,包括1431 bp的開放閱讀框(open reading frame,ORF),96 bp的5’端非翻譯區(qū)(UTR)和654 bp的3’-UTR。ORF編碼477個(gè)氨基酸,預(yù)測分子量為54 kDa,理論等電點(diǎn)為8.03。SbCAT氨基酸與其它所選動(dòng)物的氨基酸具有較高的相似性,其相似度為68%-96%,SbCAT氨基酸具有CAT基因家族的特征性序列,包括CAT活性位點(diǎn)(61FNRERIPE RVVHAKGAG77),1個(gè)亞鐵血紅素結(jié)合位點(diǎn)(351RLFSYPDTH359)及3個(gè)催化位點(diǎn)殘基His-72,Asn-145和Tyr-355。此外,SbCAT還具有保守的亞鐵血紅素結(jié)合口袋與還原型輔酶Ⅱ(NADPH)結(jié)合位點(diǎn)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測了SbCAT的組織表達(dá)特征。結(jié)果顯示,SbCAT mRNA在所檢測的6種組織中均有表達(dá),其中在外套膜中表達(dá)水平量較高,在肝胰腺和血淋巴中表達(dá)量較低。經(jīng)鰻弧菌和金黃色葡萄球菌刺激后,除鰻弧菌刺激組的外套膜表達(dá)量一直較低,其他組織均表現(xiàn)出先上升再下降的趨勢。SbGSTμ基因全長1040 bp,包括648 bp的開放閱讀框(open reading frame,ORF),144 bp的5’端非翻譯區(qū)(UTR)和248 bp的3’-UTR。ORF編碼216個(gè)氨基酸,預(yù)測分子量為24.9 kDa,理論等電點(diǎn)為8.11。SbGSTμ氨基酸與其它所選動(dòng)物的氨基酸具有較高的相似性,其相似度為49%-70%。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測了SbGSTμ的組織表達(dá)特征。結(jié)果顯示,SbGSTμmRNA在所檢測的6種組織中均有表達(dá),經(jīng)鰻弧菌和金黃色葡萄球菌和CuSO4刺激后,各個(gè)組織均表現(xiàn)出先上升再下降的趨勢。將該基因的編碼區(qū)重組到p ET-28(a+)載體后在大腸桿菌中得到誘導(dǎo)表達(dá)。重組蛋白SbGSTμ濃度為0.487 mg/ml,蛋白活性的最適pH和溫度分別為7.4和40℃。經(jīng)體外攻毒試驗(yàn),重組蛋白SbGSTμ能夠減少BaP對(duì)DNA堿基的損傷。
【圖文】：

用 Clustalx 對(duì) SbGSTμ氨基酸序列與其他 10 種動(dòng)物的氨基酸序列進(jìn)行了多序比對(duì)（圖 2-2）。SbGSTμ 氨基酸序列與九孔螺的相似性最高，為 70%，與圖-2 的其他動(dòng)物的相似性也超過了 49%。，用 Mega 5.0 軟件以鄰位相接法（NJ 法）建了 GSTμ 氨基酸的進(jìn)化樹（圖 2-3），，結(jié)構(gòu)顯示，魁蚶先與 μ 家族的軟體動(dòng)物為一支，再和 μ 家族其他動(dòng)物聚為一支，最后和其他 GST 家族的聚為一支。

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文l-length of cDNAand deduced amino acid sequencATG) and stop codon (TAA) are highlighted. P lines. Predicted C-terminal is shaded. μ nd ploy(A) are underlined with continuous and bro
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S917.4

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本文編號(hào)：2706654