【摘要】：羅非魚(yú)是我國(guó)南方的重要淡水養(yǎng)殖魚(yú)類。近年來(lái),由無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae,SA)導(dǎo)致的鏈球菌病具有高發(fā)病率和高死亡率,每年高溫期均大面積爆發(fā),對(duì)羅非魚(yú)產(chǎn)業(yè)造成巨大影響,經(jīng)濟(jì)損失巨大,成為制約羅非魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展的最主要因素。目前。對(duì)羅非魚(yú)鏈球菌病仍缺乏安全高效的防控方法,迫切需要開(kāi)展與其致病機(jī)制相關(guān)的研究,為尋找羅非魚(yú)鏈球菌病的有效防治途徑奠定基礎(chǔ)。溫度是影響羅非魚(yú)鏈球菌病爆發(fā)的重要環(huán)境因子之一。為了解溫度對(duì)宿主和病原菌生理狀態(tài)的影響,本文選取從患病羅非魚(yú)分離的無(wú)乳鏈球菌致病菌株P(guān)BSA05和PBSA52,考察了其在25℃、30℃和35℃的生長(zhǎng)情況和部分毒力因子的變化,并檢測(cè)了宿主尼羅羅非魚(yú)在不同水溫時(shí)的血清非特異性免疫指標(biāo)。結(jié)果表明,在本研究的3個(gè)實(shí)驗(yàn)溫度下,兩株無(wú)乳鏈球菌菌株的生長(zhǎng)速度與溫度呈正相關(guān),且35℃時(shí)的最高菌濃度比其他2個(gè)實(shí)驗(yàn)溫度下略有增加;菌株的溶血能力也與溫度呈正相關(guān),35℃時(shí)的溶血能力均顯著高于25℃;對(duì)惰性基質(zhì)的非特異性粘附和對(duì)羅非魚(yú)體表粘液的特異性粘附隨溫度升高而顯著增強(qiáng)。菌株P(guān)BSA05在30℃培養(yǎng)時(shí)透明質(zhì)酸酶活性最高,25℃培養(yǎng)時(shí)透明質(zhì)酸酶的活性最低,菌株P(guān)BSA52的透明質(zhì)酸酶活性受溫度影響不明顯。以羅非魚(yú)全血孵育2株致病菌,高溫培養(yǎng)菌的存活率顯著增加。不同溫度對(duì)羅非魚(yú)血清非特異性免疫的影響研究結(jié)果表明,羅非魚(yú)血清總抗氧化能力隨溫度增加而降低,35℃時(shí)總抗氧化能力顯著低于25℃時(shí);堿性磷酸酶活性隨溫度升高而下降,35℃時(shí)的酶活力顯著低于25℃。血清溶菌酶活性在30℃時(shí)顯著高于25℃和35℃,在35℃時(shí)活性最弱。羅非魚(yú)血清超氧化物歧化酶和補(bǔ)體C3的活力在不同實(shí)驗(yàn)溫度下無(wú)顯著變化。以3×107 CFU/mL菌液對(duì)羅非魚(yú)進(jìn)行腹腔注射感染(0.1mL/尾),結(jié)果菌株P(guān)BSA05和PBSA52在25℃對(duì)羅非魚(yú)的致死率分別為38.33%和16.67%,35℃時(shí)的致死率為分別為81.67%和71.67%。上述結(jié)果表明溫度變化影響病原菌和宿主的生理狀態(tài),兩者共同作用導(dǎo)致不同溫度下羅非魚(yú)鏈球菌病的發(fā)病率和危害程度明顯不同。為了從代謝水平上闡明溫度變化對(duì)病原體的影響,通過(guò)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)技術(shù)結(jié)合模式識(shí)別方法和代謝途徑分析,研究了致病性無(wú)乳鏈球菌PBSA05和PBSA52在25℃和35℃進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)的胞內(nèi)代謝物組。從兩株菌種共找到34種變化一致的代謝物作為無(wú)乳鏈球菌受溫度影響的潛在生物標(biāo)志物。無(wú)乳鏈球菌在不同溫度下的代謝狀態(tài)明顯不同,溫度變化對(duì)核酸代謝、糖代謝、氨基酸代謝和脂類代謝均有影響。35℃時(shí)大量核苷酸及其衍生物,能量物質(zhì)、細(xì)胞壁的組分和與應(yīng)激調(diào)節(jié)物質(zhì),如甘油醛-3-磷酸、焦谷氨酸、谷氨酸、D-丙氨酰-D-丙氨酸、甘油磷酸膽堿、脫磷酸乙酰輔酶A、氧化型谷胱甘肽的含量顯著增加。而甘露糖、麥芽三糖、6-磷酸乙酰葡糖胺、尿嘧啶、脯氨酸和瓜氨酸等形成莢膜、抗原和毒力蛋白的前體物質(zhì)在高溫時(shí)含量降低。代謝的變化主要與無(wú)乳鏈球菌的能量代謝、碳源的選擇性利用、核苷酸水平、蛋白質(zhì)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)合成以及應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)。高溫下穩(wěn)定期的無(wú)乳鏈球菌代謝活性降低,但對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性增強(qiáng),對(duì)宿主粘附、定植、入侵和抵抗免疫清除的能力增強(qiáng)。本研究首次確定了無(wú)乳鏈球菌對(duì)溫度變化的代謝響應(yīng),其結(jié)果有助于揭示其致病機(jī)制,并為尋找有效的羅非魚(yú)鏈球菌病防控方法奠定了理論基礎(chǔ)。采用基于氣象色譜串聯(lián)質(zhì)譜(GC/MS)技術(shù)的代謝組學(xué)方法比較了羅非魚(yú)在水溫為25℃和35℃時(shí)的血清代謝譜,采用主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)模型可以根據(jù)檢測(cè)到的278個(gè)有效峰將不同溫度的血清樣本點(diǎn)分開(kāi)。利用t檢驗(yàn)(p0.1)結(jié)合正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)分析(投影重要度,VIP1.0),從識(shí)別出的87種代謝物中篩選到17種差異代謝物。35℃時(shí)羅非魚(yú)血清中的肌醇、核糖、N-乙酰甘露糖胺、羥胺、乳酸、3,6-脫水半乳糖、氨基甲酰基天冬氨酸、甘油酸、a-酮戊二酸、戊二酸、3-羥基脯氨酸和3-羥基甲基戊二酸含量比25℃時(shí)上升,而木糖、鳥(niǎo)苷、油酸、棕櫚油酸和N-乙酰半乳糖胺的含量比25℃時(shí)下降。代謝途徑分析顯示,羅非魚(yú)的甘油脂代謝、磷酸肌醇代謝、戊糖和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換、三羧酸循環(huán)、丙氨酸天冬氨酸和谷氨酸代謝、嘌呤代謝受到溫度變化的影響。高溫環(huán)境使羅非魚(yú)能量代謝受到擾動(dòng),氨基酸分解增強(qiáng),蛋白質(zhì)合成減慢,脂肪分解加速。通過(guò)灌胃和腹腔注射兩種方式對(duì)羅非魚(yú)外源性補(bǔ)充木糖,結(jié)果表明,通過(guò)腹腔注射補(bǔ)充木糖可以提高羅非魚(yú)的血清總抗氧化能力和堿性磷酸酶活性,而通過(guò)灌胃補(bǔ)充木糖對(duì)上述兩種血清非特異性免疫指標(biāo)無(wú)顯著影響。研究結(jié)果為提高羅非魚(yú)對(duì)高溫環(huán)境的適應(yīng)性,預(yù)防高溫期鏈球菌病的發(fā)生提供了參考。對(duì)25℃和35℃感染無(wú)乳鏈球菌的羅非魚(yú)血清進(jìn)行GC/MS代謝組學(xué)分析,比較不同溫度下羅非魚(yú)感染無(wú)乳鏈球菌后的血清代謝譜變化。結(jié)果表明,25℃組和35℃組感染無(wú)乳鏈球菌的羅非魚(yú)與未感染羅非魚(yú)的血清樣本均可以通過(guò)OPLS-DA模型分開(kāi)。血清中受到較大影響的代謝物是碳水化合物和脂類物質(zhì)。35℃時(shí)羅非魚(yú)對(duì)感染無(wú)乳鏈球菌的代謝響應(yīng)比25℃時(shí)更強(qiáng)烈。以O(shè)PLS-DA結(jié)合變化倍數(shù)(VIP1.0,Foldchange1.2或0.8)作為判斷標(biāo)準(zhǔn),從25℃和35℃組分別篩選到21種和27種潛在代謝標(biāo)志物。羅非魚(yú)感染無(wú)乳鏈球菌后,25℃組有6條代謝途徑受到影響,35℃組有8條代謝途徑受到影響,其中共同包含的代謝途徑是花生四烯酸代謝、糖酵解或糖異生和磷酸戊糖途徑。感染無(wú)乳鏈球菌使羅非魚(yú)血清中6-磷酸葡萄糖的含量增加,2,6-二磷酸果糖和花生四烯酸含量降低,表明糖酵解受到抑制,花生四烯酸代謝相關(guān)的炎性反應(yīng)增強(qiáng),并且糖代謝受阻礙的程度與羅非魚(yú)在不同溫度下的發(fā)病程度相關(guān)。對(duì)人工感染無(wú)乳鏈球菌的羅非魚(yú)通過(guò)腹腔注射外源性補(bǔ)充1,6-二磷酸果糖作為糖酵解促進(jìn)劑,5mg/尾和1Omg/尾,每天1次,連續(xù)5天,分別使羅非魚(yú)存活率從31.11%提高至42.22%和57.78%。利用功能代謝組學(xué)調(diào)整代謝網(wǎng)絡(luò)對(duì)無(wú)乳鏈球菌引起的羅非魚(yú)鏈球菌病進(jìn)行調(diào)控,為進(jìn)一步探討羅非魚(yú)鏈球菌病的發(fā)病機(jī)制和尋找有效防治方法奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

？邐－％邋ｆｔ逡逑圖２－２不同培養(yǎng)溫度的無(wú)乳鏈球菌莢膜和細(xì)菌形態(tài)逡逑Ｆｉｇ．邋２－２邋Ｔｈｅ邋ｃａｐｓｕｌａｒ邋ｏｆ邋Ｓ．邋ａｇａｌａｃｔｉａｅ邋ａｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ逡逑注：圖中箭頭表示莢膜位置逡逑Ｎｏｔｅ：邋Ｔｈｅ邋ａｒｒｏｗｓ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｔｈｅ邋ｌｏｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃａｐｓｕｌａｒ．逡逑３３逡逑

３．２環(huán)境溫度對(duì)羅非魚(yú)非特異性免疫力的影響逡逑３．２．１溫度對(duì)羅非魚(yú)血清總抗氧化能力的影響逡逑對(duì)不同水溫中的羅非魚(yú)血清總抗氧化能力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示（圖２－６），水溫逡逑為２５°Ｃ、３０°Ｃ和３５°Ｃ時(shí)，羅非魚(yú)血清的總抗氧化能力隨溫度上升而降低（；？＜０．０５），逡逑３５°Ｃ時(shí)的血清抗氧化能力顯著低于２５°Ｃ、３０°Ｃ時(shí)。逡逑８－，，逡逑｜邋｜邋＿逡逑。Ｈ邐Ｈ邐Ｂｂ！逡逑ｗ邐Ｉ邐ｉ邐Ｉ逡逑２５°Ｃ邐３０°Ｃ邐３５°Ｃ逡逑溫度逡逑圖２－６溫度對(duì)羅非魚(yú)血清總抗氧化能力的影響逡逑Ｆｉｇ．邋２－６邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ邋ｏｎ邋ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｅ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｏｆ邋ｔｉｌａｐｉａ邋ｓｅｒｕｍ逡逑３．２．２溫度對(duì)羅非魚(yú)血清ＳＯＤ活性的影響逡逑不同溫度下羅非魚(yú)血清ＳＯＤ活性測(cè)定及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)圖２－７。２５１時(shí)羅非魚(yú)血逡逑清ＳＯＤ活力最低，３５°Ｃ時(shí)ＳＯＤ活力略高于其他溫度時(shí)，但各組間無(wú)顯著性差異逡逑（；？＞０．０５）邋0逡逑１００１邐ａ邐ａ邐ａ逡逑＾邋８０邋－邐Ａ邋ｊ邋ＦＨｌｃ？逡逑ｉ：逡逑Ｕ邋－ｊ邐ｉ邐！邐１逡逑２５°Ｃ邐３０°Ｃ邐３５°Ｃ逡逑溫度逡逑圖２－７溫度對(duì)羅非魚(yú)血清ＳＯＤ的影響逡逑Ｆｉｇ．邋２－７邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ＳＯＤ邋ｏｆ邋ｔｉｌａｐｉａ逡逑３．２．３溫度對(duì)羅非魚(yú)血清溶菌酶活性的影響逡逑從圖２－８可以看出，３０°Ｃ組的羅非魚(yú)血清溶菌酶活性最強(qiáng)，顯著高于２５°Ｃ組和３５°Ｃ逡逑組（ｐ＜０．０５）
【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S943


本文編號(hào)：2704259