【摘要】：近年來(lái),對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)作為我國(guó)的重要產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展,隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和集約化的養(yǎng)殖模式推廣,對(duì)蝦病害在我國(guó)呈高發(fā)趨勢(shì),我國(guó)每年因?qū)ξr病害造成的損失多達(dá)數(shù)十億元。對(duì)蝦黃頭病是重要的對(duì)蝦病害之一,二十年來(lái)給世界對(duì)蝦養(yǎng)殖造成嚴(yán)重?fù)p失。該病毒致病力強(qiáng),一旦感染發(fā)病,死亡率很高,且很難防治。該病多發(fā)生于東南亞及澳洲地區(qū),此前從未對(duì)我國(guó)養(yǎng)殖對(duì)蝦造成損失。2012年,我們采用OIE檢測(cè)手冊(cè)的YHV套式RT-PCR方法首次從河北地區(qū)的發(fā)病對(duì)蝦內(nèi)檢測(cè)到該病毒,并進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。為查明YHV在我國(guó)的存在和變異情況,本研究采用世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)《水生動(dòng)物診斷手冊(cè)》中YHV套式RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)2012-2014年采集的299份樣品進(jìn)行了YHV監(jiān)測(cè),并對(duì)部分YHV陽(yáng)性樣品基因進(jìn)行了克隆測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析。流行病學(xué)調(diào)查表明,299份樣品中YHV的陽(yáng)性率為11%,我國(guó)養(yǎng)殖的中國(guó)明對(duì)蝦、凡納濱對(duì)蝦、日本囊對(duì)蝦以及羅氏沼蝦的部分樣品中均檢出了YHV陽(yáng)性,中國(guó)明對(duì)蝦和羅氏沼蝦是本次調(diào)查中新發(fā)現(xiàn)的YHV自然宿主,而且YHV在中國(guó)明對(duì)蝦中的檢出率最高,調(diào)查結(jié)果對(duì)增補(bǔ)YHV的宿主范圍有重要意義。對(duì)6份較強(qiáng)陽(yáng)性樣品YHV基因組ORF1b內(nèi)1002bp的分型片段進(jìn)行克隆測(cè)序和序列分析,序列比對(duì)結(jié)果顯示陽(yáng)性樣品的YHV與目前已知YHV的6個(gè)基因型相似度為81.0%~90.5%,系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析顯示6份陽(yáng)性樣品歸于同一分支,但與已知YHV的6個(gè)基因型均不在同一分支內(nèi),其與YHV基因1型親緣關(guān)系較近。對(duì)陽(yáng)性樣品YHV基因組ORF3內(nèi)編碼gp116蛋白的一段序列進(jìn)行克隆測(cè)序,發(fā)現(xiàn)其序列長(zhǎng)度為509bp,與YHV1-a型的545bp、YHV 1-b型的383bp和YHV-2型的476bp均不同;依據(jù)該片段構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示,6份陽(yáng)性樣品歸于同一分支,與YHV已知的6個(gè)基因型不同,其與YHV-1型親緣關(guān)系較近,且與YHV1-a型相似度大于YHV1-b型。對(duì)其中2份樣品的ORF2序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn),2份樣品序列相似性為99.8%,蛋白序列完全相同,與YHV-1型的序列相似度為85.9%,與GAV相似性為80.9%。通過(guò)YHV核酸檢測(cè)和序列比對(duì)結(jié)果表明,感染我國(guó)養(yǎng)殖對(duì)蝦的YHV為一種新的株型。這為研究我國(guó)對(duì)蝦新發(fā)疫病的病原學(xué)病因提供了重要信息,該結(jié)果也表明我國(guó)養(yǎng)殖對(duì)蝦正面臨著新的病害威脅。本研究在YHV中國(guó)株全基因組序列的基礎(chǔ)上,通過(guò)對(duì)YHV中國(guó)株和YHV已知株系的全基因組進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn),YHV中國(guó)株與YHV已知株系全基因組的相似度為75.4%-82.3%,其中ORF2內(nèi)約200bp片段與已知YHV基因型為共同保守序列,ORF1內(nèi)CR2片段存在約250bp序列保守性更高。并根據(jù)CR2內(nèi)保守序列設(shè)計(jì)相關(guān)的LAMP通用引物,對(duì)YHV病毒所有基因型進(jìn)行檢測(cè)。YHV的致病性基因型主要為YHV-1型,為研究本實(shí)驗(yàn)室新發(fā)現(xiàn)YHV病毒的致病力,挑選20120706(河北唐海)、20131018(青島即墨)樣品進(jìn)行人工感染凡納濱對(duì)蝦實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,20120706樣品的累計(jì)死亡率為75%,20131018樣品的累計(jì)死亡率為93.33%,這與YHV-1型的高死亡率相似,說(shuō)明YHV中國(guó)株為致病性毒株。此前,研究者從世界各地的患病對(duì)蝦中已分離到Y(jié)HV的6個(gè)基因型,更多基因型正在陸續(xù)被發(fā)現(xiàn),根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表的部分基因序列,泰國(guó)學(xué)者將YHV中國(guó)株暫命名為YHV-9。我國(guó)新發(fā)YHV與這些已知基因型在進(jìn)化上的親緣關(guān)系如何,發(fā)病對(duì)蝦的種類和地區(qū)分布均尚無(wú)報(bào)道。本研究通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查及YHV-9基因測(cè)序的基礎(chǔ)上,對(duì)我國(guó)不同地理區(qū)域YHV樣品ORF1、ORF2和ORF3序列與已知YHV株系的同源性進(jìn)行分析,以期闡明YHV中國(guó)株與已知YHV株系在進(jìn)化上的關(guān)系,豐富對(duì)YHV基因組變異和進(jìn)化的認(rèn)識(shí),為YHV的有效防治提供基礎(chǔ)理論知識(shí)。
【圖文】：

就能出現(xiàn)明亮的 794bp 的目的條帶（圖 2-1 a,b），，其中 2 份來(lái)自山東的中國(guó)明對(duì)蝦樣品陽(yáng)性強(qiáng)，其他 4 份樣品陽(yáng)性較弱。6 份樣品編號(hào)分別為 20130301-ZJ（廣東，凡納濱對(duì)蝦）、20130902-JX（浙江，羅氏沼蝦）、20120706-TH（河北，中國(guó)明對(duì)蝦）、20140707-JM（山東，中國(guó)明對(duì)蝦）、20131018-JM（山東，中國(guó)明對(duì)蝦）、20120628-HG（天津，凡納濱對(duì)蝦）。M 1 2 3 4 5 6 B P1 2 3 4 5 6 B P M

Fig. 1 Result of detecting YHV by nested RT-PCRM: Marker；B: 空白對(duì)照；P: 陽(yáng)性對(duì)照；a: 樣品第一步 PCR 結(jié)果；b: 樣品第二步 PCR 結(jié)1：20130301-ZJ；2：20130902-JX；3：20120706-TH；4：20140707-JM；5：20121018-JM；20120628-HG
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S945.4

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2704133