【摘要】：近年來,對蝦養(yǎng)殖業(yè)作為我國的重要產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展,隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和集約化的養(yǎng)殖模式推廣,對蝦病害在我國呈高發(fā)趨勢,我國每年因?qū)ξr病害造成的損失多達(dá)數(shù)十億元。對蝦黃頭病是重要的對蝦病害之一,二十年來給世界對蝦養(yǎng)殖造成嚴(yán)重?fù)p失。該病毒致病力強(qiáng),一旦感染發(fā)病,死亡率很高,且很難防治。該病多發(fā)生于東南亞及澳洲地區(qū),此前從未對我國養(yǎng)殖對蝦造成損失。2012年,我們采用OIE檢測手冊的YHV套式RT-PCR方法首次從河北地區(qū)的發(fā)病對蝦內(nèi)檢測到該病毒,并進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。為查明YHV在我國的存在和變異情況,本研究采用世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)《水生動(dòng)物診斷手冊》中YHV套式RT-PCR檢測方法對2012-2014年采集的299份樣品進(jìn)行了YHV監(jiān)測,并對部分YHV陽性樣品基因進(jìn)行了克隆測序及系統(tǒng)發(fā)育分析。流行病學(xué)調(diào)查表明,299份樣品中YHV的陽性率為11%,我國養(yǎng)殖的中國明對蝦、凡納濱對蝦、日本囊對蝦以及羅氏沼蝦的部分樣品中均檢出了YHV陽性,中國明對蝦和羅氏沼蝦是本次調(diào)查中新發(fā)現(xiàn)的YHV自然宿主,而且YHV在中國明對蝦中的檢出率最高,調(diào)查結(jié)果對增補(bǔ)YHV的宿主范圍有重要意義。對6份較強(qiáng)陽性樣品YHV基因組ORF1b內(nèi)1002bp的分型片段進(jìn)行克隆測序和序列分析,序列比對結(jié)果顯示陽性樣品的YHV與目前已知YHV的6個(gè)基因型相似度為81.0%~90.5%,系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示6份陽性樣品歸于同一分支,但與已知YHV的6個(gè)基因型均不在同一分支內(nèi),其與YHV基因1型親緣關(guān)系較近。對陽性樣品YHV基因組ORF3內(nèi)編碼gp116蛋白的一段序列進(jìn)行克隆測序,發(fā)現(xiàn)其序列長度為509bp,與YHV1-a型的545bp、YHV 1-b型的383bp和YHV-2型的476bp均不同;依據(jù)該片段構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示,6份陽性樣品歸于同一分支,與YHV已知的6個(gè)基因型不同,其與YHV-1型親緣關(guān)系較近,且與YHV1-a型相似度大于YHV1-b型。對其中2份樣品的ORF2序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn),2份樣品序列相似性為99.8%,蛋白序列完全相同,與YHV-1型的序列相似度為85.9%,與GAV相似性為80.9%。通過YHV核酸檢測和序列比對結(jié)果表明,感染我國養(yǎng)殖對蝦的YHV為一種新的株型。這為研究我國對蝦新發(fā)疫病的病原學(xué)病因提供了重要信息,該結(jié)果也表明我國養(yǎng)殖對蝦正面臨著新的病害威脅。本研究在YHV中國株全基因組序列的基礎(chǔ)上,通過對YHV中國株和YHV已知株系的全基因組進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn),YHV中國株與YHV已知株系全基因組的相似度為75.4%-82.3%,其中ORF2內(nèi)約200bp片段與已知YHV基因型為共同保守序列,ORF1內(nèi)CR2片段存在約250bp序列保守性更高。并根據(jù)CR2內(nèi)保守序列設(shè)計(jì)相關(guān)的LAMP通用引物,對YHV病毒所有基因型進(jìn)行檢測。YHV的致病性基因型主要為YHV-1型,為研究本實(shí)驗(yàn)室新發(fā)現(xiàn)YHV病毒的致病力,挑選20120706(河北唐海)、20131018(青島即墨)樣品進(jìn)行人工感染凡納濱對蝦實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,20120706樣品的累計(jì)死亡率為75%,20131018樣品的累計(jì)死亡率為93.33%,這與YHV-1型的高死亡率相似,說明YHV中國株為致病性毒株。此前,研究者從世界各地的患病對蝦中已分離到Y(jié)HV的6個(gè)基因型,更多基因型正在陸續(xù)被發(fā)現(xiàn),根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表的部分基因序列,泰國學(xué)者將YHV中國株暫命名為YHV-9。我國新發(fā)YHV與這些已知基因型在進(jìn)化上的親緣關(guān)系如何,發(fā)病對蝦的種類和地區(qū)分布均尚無報(bào)道。本研究通過流行病學(xué)調(diào)查及YHV-9基因測序的基礎(chǔ)上,對我國不同地理區(qū)域YHV樣品ORF1、ORF2和ORF3序列與已知YHV株系的同源性進(jìn)行分析,以期闡明YHV中國株與已知YHV株系在進(jìn)化上的關(guān)系,豐富對YHV基因組變異和進(jìn)化的認(rèn)識,為YHV的有效防治提供基礎(chǔ)理論知識。
【圖文】：

就能出現(xiàn)明亮的 794bp 的目的條帶（圖 2-1 a,b），，其中 2 份來自山東的中國明對蝦樣品陽性強(qiáng)，其他 4 份樣品陽性較弱。6 份樣品編號分別為 20130301-ZJ（廣東，凡納濱對蝦）、20130902-JX（浙江，羅氏沼蝦）、20120706-TH（河北，中國明對蝦）、20140707-JM（山東，中國明對蝦）、20131018-JM（山東，中國明對蝦）、20120628-HG（天津，凡納濱對蝦）。M 1 2 3 4 5 6 B P1 2 3 4 5 6 B P M

Fig. 1 Result of detecting YHV by nested RT-PCRM: Marker；B: 空白對照；P: 陽性對照；a: 樣品第一步 PCR 結(jié)果；b: 樣品第二步 PCR 結(jié)1：20130301-ZJ；2：20130902-JX；3：20120706-TH；4：20140707-JM；5：20121018-JM；20120628-HG
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S945.4

【共引文獻(xiàn)】

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1 童桂香;韋信賢;吳偉軍;吳祥慶;黃國秋;黃玉柳;葉欣宇;黎小正;;廣西凡納濱對蝦IHHNV感染情況的調(diào)查與分析[J];南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2013年12期

2 劉群;黃P";楊昊霖;楊冰;劉筍;王海亮;王勤濤;劉飛;張慶利;;疑患EMS/AHPNS對蝦中檢出黃頭病毒的一種新株型[J];海洋與湖沼;2014年04期

3 彭小莉;劉棠;徐維佳;王群力;陳偉玲;陳雙雅;王景明;謝明星;;對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒衣殼蛋白基因的克隆表達(dá)及抗體制備[J];臺(tái)灣海峽;2008年01期

4 吳昊;徐麗美;楊豐;;對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒(福建株)基因組的克隆[J];臺(tái)灣海峽;2008年02期

5 侯路紅;林梵宇;;對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒熒光病毒樣顆粒的構(gòu)建[J];應(yīng)用海洋學(xué)學(xué)報(bào);2015年03期

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1 黃海洪;凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）抗哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）感染的免疫應(yīng)答特征研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2014年

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1 徐孝棟;凡納濱對蝦育種群體遺傳參數(shù)評估[D];大連海洋大學(xué);2014年

2 楊昊霖;對蝦白斑綜合征病毒和黃頭病毒等溫?cái)U(kuò)增檢測方法的建立及應(yīng)用[D];上海海洋大學(xué);2014年

本文編號：2704133