發(fā)布時(shí)間：2020-06-08 08:24

【摘要】：本文主要研究了養(yǎng)殖刺參(Apostichopus japonicus)早期發(fā)育各階段幼體消化道菌群結(jié)構(gòu)變化,并分析了環(huán)境(培育用水、餌料)菌群結(jié)構(gòu)對刺參幼體消化道菌群結(jié)構(gòu)的影響,同時(shí)對分離自幼體消化道的菌株進(jìn)行了益生菌的初步篩選,以期為解析刺參消化道菌群的形成過程和演替規(guī)律以及養(yǎng)殖用益生菌的篩選與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1.采用傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)方法,對養(yǎng)殖刺參早期發(fā)育各階段幼體體內(nèi)及環(huán)境(投入餌料、培育用水)菌群的組成與結(jié)構(gòu)展開研究,對分離的優(yōu)勢細(xì)菌進(jìn)行分子鑒定,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了刺參幼體體內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)與環(huán)境菌群結(jié)構(gòu)相關(guān)性分析。細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果表明,在幼體開口及投喂餌料以后,耳狀幼體和樽形幼體體內(nèi)可分離獲得可培養(yǎng)細(xì)菌,但數(shù)量級較低(10~1 CFU/ind);發(fā)育至稚參期以后,消化道可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)急劇增加,并在4月齡時(shí)期達(dá)到10~8 CFU/g數(shù)量級�？膳囵B(yǎng)弧菌結(jié)果也呈現(xiàn)類似變化趨勢,幼體體內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌中弧菌占比為2.2%~77.3%。對環(huán)境菌群的細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果表明,培育用水中細(xì)菌含量變化不顯著,隨著幼體發(fā)育期餌料的轉(zhuǎn)變,不同時(shí)期餌料中細(xì)菌含量差異顯著,幼體體內(nèi)細(xì)菌數(shù)量與餌料細(xì)菌總數(shù)存在顯著相關(guān)性。自整個(gè)養(yǎng)殖系統(tǒng)中共分離到65株優(yōu)勢細(xì)菌,根據(jù)16S rDNA進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明所分離的65株優(yōu)勢菌歸屬于14個(gè)屬43種細(xì)菌。各菌株在幼體及環(huán)境分布統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明Halomonas alkaliantarctica為耳狀幼體、樽形幼體共有優(yōu)勢菌;1月齡時(shí)期,Vibrio atlanticus、Vibrio natriegens是幼體、餌料、培育用水的共有優(yōu)勢菌,Bacillus tequilensis是幼體、餌料的共有優(yōu)勢菌;2月齡時(shí)期,Vibrio alginolyticus是消化道和餌料的共同優(yōu)勢菌;2月至4月齡時(shí)期,Vibrio fortis是其消化道的共有優(yōu)勢菌;6月齡時(shí)期,Bacillus siamensis是幼體、餌料、培育用水的共有優(yōu)勢菌。相關(guān)性分析結(jié)果表明在幼體發(fā)育初期,其體內(nèi)菌群與養(yǎng)殖用水的相關(guān)性較大,而隨著幼體發(fā)育,其體內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)與餌料的相關(guān)性逐漸增加。2.應(yīng)用高通量測序技術(shù),對養(yǎng)殖刺參早期發(fā)育各階段幼體體內(nèi)及環(huán)境(投入餌料、培育用水)菌群的組成與結(jié)構(gòu)展開更為深入的研究。自受精卵至樽形幼體時(shí)期,變形菌門、擬桿菌門及藍(lán)細(xì)菌門的總豐度始終達(dá)90%以上;自1月齡至4月齡稚參時(shí)期,隨著藍(lán)細(xì)菌門、浮霉菌門、疣微菌門總豐度的增加,變形菌門的比例大幅降低并在4月齡稚參時(shí)期達(dá)到最低水平,擬桿菌門的比例則始終處于較低水平(0.91%~3.73%);在6月齡稚參時(shí)期,變形菌門又重新占據(jù)優(yōu)勢地位(80.32%),而藍(lán)細(xì)菌門、浮霉菌門、疣微菌門比例則降至較低水平。在科水平上,假交替單胞菌科是受精卵時(shí)期的優(yōu)勢菌科;黃桿菌科在原腸胚期占絕對優(yōu)勢;紅桿菌科在原腸胚(G)至樽形幼體(D)時(shí)期豐度較高且不斷增加(25.11%~34.85%);交替單胞菌科在耳狀幼體(A)時(shí)期比例相對較高,為14.73%;弧菌科在耳狀幼體(A)時(shí)期比例相對較高(18.62%),在6月齡(J6)則占絕對優(yōu)勢地位(78.25%);浮霉菌科、疣微菌科為1月齡(J1)至6月齡(J6)的優(yōu)勢菌群,豐度分別為28.27%~40.22%、9.56%~21.37%。對幼體菌群與環(huán)境菌群進(jìn)行相關(guān)性分析表明,早期發(fā)育幼體菌群與培育用水菌群相似性更高,而到發(fā)育后期,幼體菌群受餌料菌群的影響較大。在科水平上,培育用水菌群、餌料菌群對幼體的菌群的影響更為復(fù)雜,幼體中的紅桿菌科、黃桿菌科細(xì)菌豐度主要受培育用水菌群影響,紅桿菌科在耳狀幼體至4月齡稚參時(shí)期(A、D、J1、J2、J4)的豐度變化,與水中該菌科的豐度變化表現(xiàn)出正相關(guān)性;黃桿菌科在耳狀幼體、樽形幼體時(shí)期(A、D)的相對豐度與水中該菌科的相對豐度更為接近。幼體中的弧菌科、浮霉菌科受餌料菌群的影響更為顯著,弧菌科在耳狀幼體(A)、6月齡稚參(J6)時(shí)期中的幼體與餌料中相對豐度,與其他時(shí)期相比均處于較高水平,而同時(shí)期的培育用水中弧菌科在各時(shí)期均處于較低水平;浮霉菌科在樽形幼體至4月齡稚參時(shí)期(D、J1、J2、J4)均處于較高水平,同階段餌料中的該菌科除4月齡時(shí)期比水中該菌群的豐度低外,其他時(shí)期則比水中的豐度高。3.通過病原拮抗實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)酶能力測定、安全性評價(jià)、生理生化及分子鑒定,對分離自刺參早期發(fā)育不同階段幼體體內(nèi)的27株菌進(jìn)行了潛在益生菌的篩選。實(shí)驗(yàn)篩選得到對假交替單胞菌和燦爛弧菌具有不同程度抑制作用的2株細(xì)菌,來源于1月齡稚參的YB-ZS_5-D對燦爛弧菌和假交替單胞菌均具有較強(qiáng)的抑制作用,來源于6月齡稚參的YB-ZS_(10)-A對假交替單胞菌的抑制作用較強(qiáng),而對燦爛弧菌的拮抗作用較弱。對兩株菌的產(chǎn)酶能力進(jìn)行了測定,在產(chǎn)淀粉酶能力方面,兩株菌的能力相當(dāng),水解圈大小達(dá)到了22~25 mm;在產(chǎn)酪蛋白酶能力方面,菌株YB-ZS_5-D明顯強(qiáng)于菌株YB-ZS_(10)-A。2株潛在益生菌不同濃度(10~7 CFU/mL、10~8 CFU/mL、10~9CFU/mL)的浸浴組的刺參均未出現(xiàn)死亡,活力良好,說明菌株YB-ZS_5-D、YB-ZS_(10)-A對刺參無害。鑒于在拮抗病原菌能力、產(chǎn)酶能力及安全性評價(jià)方面,菌株YB-ZS_5-D均優(yōu)于菌株YB-ZS_(10)-A,因此選擇菌株YB-ZS_5-D進(jìn)行了后續(xù)的細(xì)菌鑒定及使用效果評價(jià)試驗(yàn),鑒定結(jié)果表明菌株YB-ZS_5-D為特基拉芽孢桿菌(Bacillus tequilensis)。不同濃度(10~3 CFU/mL、10~4 CFU/mL、10~5 CFU/mL、10~6CFU/mL)的菌株YB-ZS_5-D浸浴實(shí)驗(yàn)效果評估結(jié)果表明,在養(yǎng)殖水中添加特基拉芽孢桿菌YB-ZS_5-D可顯著提高刺參的特定生長率(SGR),并可顯著提高腸道胰蛋白酶(TRY)、淀粉酶(AMS)和體腔液ACP、AKP、SOD酶活力,具有良好的刺參養(yǎng)殖用微生態(tài)制劑的商業(yè)價(jià)值,基于效果評價(jià)及成本考慮,添加量以10~3 CFU/mL為宜。
【圖文】：

圖 2-1 不同發(fā)育時(shí)期刺參幼體體內(nèi)菌群與環(huán)境菌群差異的主成分分析. 2-1 PCA of the samples among the intestine of sea cucumber at different developmental sand its aquaculture system 討論

圖 3-2 各時(shí)期刺參幼體菌群與環(huán)境菌群 OTUs 比較韋恩圖(Z：受精卵；G：原腸胚；A：耳狀幼體；D：樽形幼體；J1：1 月齡稚參；J2：2 月齡稚參；J4：4 月齡稚參；J6：6 月齡稚參；W：培育用水；B：餌料)Fig. 3-2 Venne diagram based on the distribution of shared OTUs between the early developmentalsea cucumber at different stages and aquaculture environment
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S968.9

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張騫月;趙婉婉;吳偉;;水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性基因污染及其研究進(jìn)展[J];中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào);2015年06期

2 關(guān)曉燕;陳仲;趙春霞;高杉;蔣經(jīng)偉;王擺;姜冰;李麗麗;顧英;董穎;;一株芽孢桿菌的分離、鑒定及其對仿刺參免疫的影響[J];水產(chǎn)科學(xué);2015年09期

3 施兆鴻;王建建;高權(quán)新;;工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖條件下云紋石斑魚消化道產(chǎn)酶菌的分離鑒定[J];中國水產(chǎn)科學(xué);2015年05期

4 史秀清;張正;王印庚;于永翔;鄧威;李華;;大菱鲆(Scophthalmus maximus)仔稚魚發(fā)育期消化道可培養(yǎng)細(xì)菌的菌群特征分析[J];漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展;2015年04期

5 王姣姣;李丹;王軼南;王俊杰;劉艷萍;常亞青;;不同養(yǎng)殖時(shí)期刺參腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)的分析[J];大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào);2015年04期

6 王洪秀;靳亮;陳慶隆;魏云輝;馬吉平;姚健;陳柳萌;鐘國祥;;橘小實(shí)蠅成蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析[J];微生物學(xué)通報(bào);2015年12期

7 王姣姣;李丹;宋堅(jiān);劉艷萍;常亞青;王軼南;;不同時(shí)期刺參養(yǎng)殖池塘海水菌群結(jié)構(gòu)分析[J];中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào);2015年02期

8 竇妍;丁君;曲凌云;劉志敏;王軼南;穆曉虎;常亞青;;秋、冬季刺參養(yǎng)殖池塘菌群的多樣性分析[J];大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào);2015年02期

9 趙坤;田相利;董雙林;李杰;王文君;;芽孢桿菌不同使用方式對刺參生長、消化和免疫防御因子的影響[J];海洋湖沼通報(bào);2015年01期

10 夏圍圍;賈仲君;;高通量測序和DGGE分析土壤微生物群落的技術(shù)評價(jià)[J];微生物學(xué)報(bào);2014年12期

，

本文編號：2702799