【摘要】：中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)俗稱河蟹,是一種重要的經(jīng)濟(jì)蟹類(lèi),在我國(guó)淡水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中占有很大的比重。然而,近年來(lái)隨著其養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和集約化程度的不斷提高,由細(xì)菌、病毒以及寄生蟲(chóng)等病原引起的各種疾病日益嚴(yán)重,給中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,其中顫抖病是中華絨螯蟹中最嚴(yán)重的病害之一。王文等通過(guò)組織病理學(xué)的觀察、細(xì)菌分離培養(yǎng)、分類(lèi)地位的研究以及人工回感實(shí)驗(yàn)等證實(shí)顫抖病的病原是一種特殊的細(xì)菌——螺原體,并正式將它命名為中華絨螯蟹螺原體(Spiroplasma eriocheiris)。前期研究表明,中華絨螯蟹螺原體主要通過(guò)河蟹的鰓或其體表進(jìn)入河蟹體內(nèi),首先侵染其靶細(xì)胞——血細(xì)胞,再在血細(xì)胞中大量繁殖并隨血液循環(huán)進(jìn)一步侵染河蟹的神經(jīng)和肌肉等組織,最終引起河蟹的顫抖病,進(jìn)而導(dǎo)致河蟹死亡。因此鑒于中華絨螯蟹螺原體的特殊性以及對(duì)河蟹的致病性,對(duì)河蟹的免疫防御機(jī)制做進(jìn)一步研究顯得尤為重要。本碩士論文在前期研究的基礎(chǔ)之上,通過(guò)基因克隆、生物信息學(xué)分析、蛋白原核表達(dá)、基因干擾,研究?jī)煞N河蟹蛋白即組織蛋白酶D和絲氨酸蛋白酶抑制劑3(EscatD和Esserpin-3)在螺原體侵染河蟹的免疫反應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮的作用。本論文將為進(jìn)一步探究螺原體在侵染過(guò)程中的河蟹免疫防御機(jī)理以及減少螺原體對(duì)河蟹養(yǎng)殖業(yè)的危害提供一定的理論依據(jù)。本論文研究結(jié)果主要包括以下三個(gè)方面:1. EscatD基因克隆、生物信息學(xué)分析、蛋白原核表達(dá)以及相關(guān)功能的研究以河蟹的血細(xì)胞cDNA為模板,通過(guò)PCR成功擴(kuò)增了中華絨螯蟹組織蛋白酶D (EscatD)。該基因的cDNA全長(zhǎng)序列為2748 bp,其中5'非翻譯區(qū)(UTR)140bp,3'UTR 1450bp,開(kāi)放閱讀框1158bp,編碼385個(gè)氨基酸,分子量約為41.66 kDa,等電點(diǎn)為6.53。序列分析表明,EscatD蛋白由信號(hào)肽、前體域和成熟域3部分組成。同源性分析表明,EscatD的氨基酸序列高度保守,與水生甲殼類(lèi)動(dòng)物相似性在80 %以上。進(jìn)化分析表明,EscatD與蝦類(lèi)的親緣關(guān)系比較近,與傳統(tǒng)分類(lèi)結(jié)果基本一致。構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-EscatD,誘導(dǎo)表達(dá)獲得了以包涵體形式存在的重組蛋白EscatD。組織表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn),EscatD在被檢測(cè)的所有器官中都有表達(dá),其中在河蟹的眼柄、血細(xì)胞、腸和神經(jīng)組織中表達(dá)量都相對(duì)較高,在心臟、肌肉和鰓中的表達(dá)量較少。上述結(jié)果為進(jìn)一步開(kāi)展EscatD的功能研究奠定重要基礎(chǔ)。2. EscatD免疫功能的初步研究EscatD屬于組織蛋白酶D家族的一員,近期的研究表明EscatD蛋白在甲殼動(dòng)物的先天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。qRT-PCR結(jié)果顯示,在螺原體刺激河蟹血細(xì)胞后,EscatDmRNA的轉(zhuǎn)錄明顯高于對(duì)照組(PBS組)。靶基因干擾后,EscatD下游基因JNK、ERK、P38和Relish的基因表達(dá)量均有所下降,螺原體感染河蟹的血細(xì)胞后,與陽(yáng)性對(duì)照組相比螺原體的拷貝數(shù)明顯增加,河蟹死亡率明顯升高,進(jìn)一步說(shuō)明EscatD在河蟹應(yīng)對(duì)螺原體的刺激中發(fā)揮著重要的免疫作用。3. Esserpin-3免疫功能的初步研究Esserpin-3屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑3家族的一員,近期的研究表明Esserpin-3蛋白在甲殼類(lèi)的先天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)表明,螺原體刺激河蟹血細(xì)胞后,Esserpin-3mRNA的轉(zhuǎn)錄明顯高于對(duì)照組(PBS組)。靶基因干擾后,Esserpin-3的上游基因LGBP的表達(dá)量升高,下游基因proPO的表達(dá)量升高;螺原體感染河蟹血細(xì)胞后,與陽(yáng)性對(duì)照組相比螺原體的拷貝數(shù)減少,河蟹的死亡率明顯降低,進(jìn)一步說(shuō)明Esserpin-3在河蟹應(yīng)對(duì)螺原體的刺激中發(fā)揮著重要的免疫作用。
【圖文】：

脊尾白蟲(chóng)下（尸邋ｃａｒｚＷｃ伣ｉｏ）、美洲龍蟲(chóng)下（／／ｏｗｏｍｓａｗｅｒｆｃｏｒａｗ）和斑逡逑節(jié)對(duì)蝦（戶ｍｏ佭—）等甲殼類(lèi)動(dòng)物的ｃａｔＤ基因聚類(lèi)，再與昆蟲(chóng)等聚類(lèi)，說(shuō)明它逡逑們的親緣關(guān)系較近，，之后才與脊椎動(dòng)物聚合（

以河蟹血細(xì)胞ＲＮＡ的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，根據(jù)ＥｓｃａｔＤ基因序列全長(zhǎng)設(shè)計(jì)逡逑引物邋ＥｓｃａｔＤ－ＯＲＦ－Ｆ邋和邋ＥｓｃａｔＤ－ＯＲＦ－Ｒ，通過(guò)邋ＰＣＲ邋（引物見(jiàn)表邋２．１）擴(kuò)增邋ＥｓｃａｔＤ邋基逡逑因的ＯＲＦ序列，進(jìn)而通過(guò)核酸電泳驗(yàn)證（圖２．４－Ａ）。將擴(kuò)增得到的ＥｓｃａｔＤ基因逡逑的ＰＣＲ產(chǎn)物，經(jīng)及ｏｉ？邋／和恐0邋／雙酶切后與ｐＥＴ－２８ａ表達(dá)載體連接，通過(guò)菌落逡逑ＰＣＲ挑選單克隆菌落，菌液ＰＣＲ后進(jìn)行核酸電泳驗(yàn)證（圖２．４－Ｂ）鑒定重組表逡逑達(dá)質(zhì)粒。對(duì)連有目的片段的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序進(jìn)一步確定讀碼框準(zhǔn)確無(wú)誤。重組逡逑質(zhì)粒被命名為ｐＥＴ－２８ａ－ＥｓｃａｔＤ。逡逑＾邐Ｍ邋１邐ｑ邋Ｎ＞Ｍ邋１２３４５６７８９邋１０逡逑…‘二：逡逑１0００邐~忓義賢跡玻矗牛螅閎紓幕虻目寺〖把糶鑰寺【淶奶羧�。Ａ．e校茫依┰齙玫降暮有罰牛螅悖幔簦牡哪垮義系鈉�，Ｍ，ＤＬ２０００。n穡牛裕玻福幔牛螅悖幔簦鬧刈櫓柿Ｑ糶鑰寺√粞〗峁保保�，邋Ｍ，辶x希模蹋擔(dān)埃埃

本文編號(hào)：2702289