【摘要】：斑馬魚(Danio rerio)作為近年來發(fā)育生物學和遺傳生物學的理想模式脊椎生物,具有胚胎體外發(fā)育且透明、產(chǎn)卵量大與人類基因組高度相似等優(yōu)勢。Kin17蛋白在各組織中普遍表達且在物種進化中具有嚴格的保守性。已有研究表明其在生物體內(nèi)具有DNA復(fù)制、損傷及修復(fù),細胞增殖、以及RNA剪接等功能。此外Kin17還有可能是轉(zhuǎn)錄因子。Kin17基因作為轉(zhuǎn)錄因子在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的所起到的作用尚未見報道。本課題選用明星脊椎模式生物--斑馬魚作為研究對象,運用逆轉(zhuǎn)錄PCR,熒光實時定量PCR,免疫細胞化學,整體胚胎原位雜交技術(shù)以及Morpholino基因抑制等技術(shù)對Kin17基因在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的表達特性及功能分析進行了初步探究。斑馬魚Kin17基因的生物信息學分析運用生物信息學軟件對斑馬魚、人、小鼠、大猩猩等生物的Kin17基因序列進行比對分析,結(jié)果顯示,通過對斑馬魚Kin17基因序列進行比對發(fā)現(xiàn)與人、大猩猩、小鼠等相似度高達75%。利用ProScale、PSIPRED和SWISS-MODEL軟件成功的預(yù)測出斑馬魚Kin17蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)。分析結(jié)果可知斑馬魚Kin17 2CKK.1.A與人類Kin17與人類Kin17蛋白相符,覆蓋率達30%。斑馬魚Kin17基因的克隆、時空表達及分析首先,為了檢測Kin17基因在各組織中的表達特性,我們通過利用RT-PCR、Q-PCR、免疫組織化學技術(shù)對其進行分析。結(jié)果表明:Kin17mRNA在原腸期前表達量較低,當胚胎發(fā)育到體節(jié)期時表達量迅速上升且穩(wěn)定在較高水平,Kin17基因轉(zhuǎn)錄本母源性存在。在斑馬魚的所有組織中均檢測到Kin17基因的表達,且高表達于卵巢、精巢、腸道、肌肉組織,特異性的表達于初級精母細胞和次級精母細胞。為了進一步明確Kin17mRNA的特定表達部位,采用整體胚胎原位雜交(WISH)的方法觀察斑馬魚胚胎發(fā)育不同時期的時空表達圖譜。結(jié)果顯示:Kin17基因在在胚胎卵裂期間就已開始表達,在發(fā)育初期呈現(xiàn)普遍性表達,但在卵裂期Kin17mRNA主要分布在生殖質(zhì)處,在咽囊期在原始生殖細胞(PGC)及視覺神經(jīng)及腦部垂體處特異性表達。當斑馬魚胚胎受精后24小時即發(fā)育到體節(jié)早期時可以我們可以明顯的觀察到有Kin17mRNA大量原始生殖細胞聚集并且分布在脊柱的兩側(cè)。在孵化期,Kin17mRNA在原始生殖細胞中仍然穩(wěn)定存在,特異性地分布在視覺神經(jīng)及腦部垂體處。通過實驗結(jié)果分析,斑馬魚Kin17基因作為一個原始生殖細胞特異性表達的基因。運用嗎啡啉基因下調(diào)技術(shù)(Morpholino knockdown)標記的反義核苷酸探針與Kin17mRNA結(jié)合,抑制基因表達,觀察胚胎發(fā)育異常現(xiàn)象。顯微注射Kin17嗎啉反義寡核苷酸使Kin17基因表達下調(diào),造成斑馬魚胚胎發(fā)育延遲,并伴有眼部缺失、腹腔腫大、尾部發(fā)育不全等不同程度的發(fā)育畸形顯現(xiàn)。以上結(jié)果顯示,Kin17基因的異常表達能調(diào)控斑馬魚胚胎的發(fā)育。綜上結(jié)果表明,Kin17基因作為母源性因子在調(diào)控斑馬魚胚胎發(fā)育中起到了至關(guān)重要的作用。Kin17基因在斑馬魚胚胎發(fā)育中的具體調(diào)控方式和作用機理將是一個值得深入探討的課題,本課題為探討斑馬魚胚胎發(fā)育機制及影響奠定了重要的理論及實驗基礎(chǔ)。
【圖文】：

4圖 1.1 斑馬魚的胚胎發(fā)育(摘自文獻[18])Fig 1.1 Zebrafish embryogenesis1.2 母源性效應(yīng)因子在斑馬魚胚胎發(fā)育中的作用在脊椎動物的發(fā)育過程中,受精卵細胞中存在少量使胚胎正常發(fā)育所需的物質(zhì)稱作母源性效應(yīng)因子[18,19]。所謂合子基因（zygotic gene）是指受母源性基因產(chǎn)物的激活并在胚胎發(fā)育過程中顯著表達的基因，合子基因表達先后有序共同調(diào)控著胚胎發(fā)育，合子基因的表達以為這斑馬魚胚胎模式的開啟。當胚胎發(fā)育進入中囊胚過渡期(midblastula transition,MBT)伴隨著部分合子基因開始表達[20]。在受精卵未進入 MBT 期時，，胚胎的發(fā)育主要依賴于卵細胞中所產(chǎn)生的以為母源性物質(zhì)來供給胚胎的正常發(fā)育，這些母源性物質(zhì)主要由未受精時的卵細胞所產(chǎn)生,胚胎的正常發(fā)育依賴于這些母源性產(chǎn)物的給養(yǎng)，例如細胞的正常分裂、胚胎的新陳代謝、細胞間的聚集和多個信號通路的調(diào)控等都依賴于這些母源性因子[21]。在斑馬魚胚胎發(fā)育中,合子基因的表達開始于合子期,當核質(zhì)比達到一定的比例時細胞

Wnt信號(摘自文獻[35]
【學位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4

【共引文獻】

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1 M.Martínez-Sales;F.García-Ximénez;F.J.Espinós;;Zebrafish as a possible bioindicator of organic pollutants with effects on reproduction in drinking waters[J];Journal of Environmental Sciences;2015年07期

2 余凱敏;馮為民;李國超;張家禹;劉麗麗;閆艷春;;毒死蜱的環(huán)境生物學效應(yīng)分析[J];生物技術(shù)通報;2015年08期

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1 常菊花;丁草胺對斑馬魚的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2012年

2 朱娜;生活垃圾填埋場滲濾液在黃土層滲漏過程中的復(fù)合生態(tài)毒理效應(yīng)研究[D];山西大學;2013年

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1 高素;氨基脲對斑馬魚（Danio rerio）抗雌激素效應(yīng)研究[D];中國海洋大學;2013年

2 楊曉溪;雙酚AF和全氟化合物對斑馬魚的毒性效應(yīng)研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2014年

本文編號：2699958