【摘要】：嗜水氣單胞菌是淡水魚類的重要致病菌,在水溫較高的季節(jié)、集約化高密度養(yǎng)殖情況下常引起養(yǎng)殖魚類暴發(fā)細菌性敗血癥等疾病,給養(yǎng)殖戶帶來重大經(jīng)濟損失。目前水產(chǎn)養(yǎng)殖上多采用抗生素防治該類病害,但抗生素的濫用不僅使致病菌產(chǎn)生抗藥性,還給環(huán)境和人類帶來危害。已有研究表明有機碳源能影響嗜水氣單胞菌的生長及毒力,但無機碳源對嗜水氣單胞菌的影響還未見報道。碳酸氫鈉具有抑菌特性,能夠抑制大腸桿菌、假單胞菌等細菌生長,但對嗜水氣單胞菌是否也有抑制作用尚未可知。因此,本文以嗜水氣單胞菌為研究對象,探討了碳酸氫鈉對嗜水氣單胞菌生長的抑制效果和抑制機制,以及碳酸氫鈉對嗜水氣單胞菌致病性和主要毒力基因表達的影響,為合理使用碳酸氫鈉抑制嗜水氣單胞菌病暴發(fā)提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。主要研究結(jié)果如下:1.碳酸氫鈉對嗜水氣單胞菌生長的影響為了探討碳酸氫鈉(NaHCO_3)對嗜水氣單胞菌的抑制效果和抑制機理,研究了不同濃度的NaHCO_3及等摩爾濃度(0.2M、0.4M、0.8M)的氯化鈉(NaCl)和碳酸氫鉀(KHCO_3)對嗜水氣單胞菌生長的影響。結(jié)果表明隨著NaHCO_3濃度的增大,嗜水氣單胞菌的生長越來越緩慢。NaHCO_3達到一定濃度后具有殺菌作用,濃度越大,嗜水氣單胞菌的死亡率越大,死亡所需時間越短。暴露12h后,0.4M、0.8M NaHCO_3中均無嗜水氣單胞菌存活,0.2M NaHCO_3中只有極少數(shù)嗜水氣單胞菌存活(存活率小于0.01%)。0.2M、04M的NaHCO_3均能有效抑制嗜水氣單胞菌生長,而添加等摩爾濃度的NaCl培養(yǎng)液中,細菌生長不受影響;添加等摩爾濃度KHCO_3的培養(yǎng)液中培養(yǎng)的嗜水氣單胞菌,其生長情況與添加NaHCO_3的嗜水氣單胞菌相似,生長被明顯抑制。結(jié)果表明NaHCO_3對嗜水氣單胞菌的抑制并非由滲透壓引起,而是與碳酸氫根有關(guān)。研究結(jié)果為有效控制嗜水氣單胞菌病提供了理論依據(jù)。2.不同濃度的碳酸氫鈉對嗜水氣單胞菌致病性的影響為探討碳酸氫鈉對嗜水氣單胞菌致病性的影響,采用不同濃度碳酸氫鈉培養(yǎng)的嗜水氣單胞菌對斑馬魚進行人工感染,并比較了添加碳酸氫鈉、葡萄糖、蔗糖培養(yǎng)的嗜水氣單胞菌對斑馬魚人工感染的效果。嗜水氣單胞菌的毒力以其對斑馬魚的半致死量大小來衡量,半致死量越高,表明細菌毒力越小。實驗結(jié)果表明:相比于未添加任何碳源的對照組嗜水氣單胞菌,添加了碳酸氫鈉培養(yǎng)的嗜水氣單胞菌對斑馬魚的半致死量明顯比對照組高,即濃度范圍在0.024M-0.096M的碳酸氫鈉能降低嗜水氣單胞菌的毒力;而且隨著碳酸氫鈉濃度的增加,嗜水氣單胞菌的毒力逐漸減小;濃度在0.024M-0.096M范圍時,添加無機碳源碳酸氫鈉培養(yǎng)的嗜水氣單胞菌毒性弱于添加葡萄糖、蔗糖等有機碳源培養(yǎng)的嗜水氣單胞菌。另外,添加葡萄糖培養(yǎng)的嗜水氣單胞菌對斑馬魚的半致死量高于添加蔗糖的,說明添加葡萄糖比添加蔗糖更能降低嗜水氣單胞菌的毒力。3.碳酸氫鈉對嗜水氣單胞菌主要毒力基因表達的影響為探討碳酸氫鈉降低嗜水氣單胞菌毒力的原因,利用熒光定量PCR技術(shù),以未添加碳酸氫鈉的嗜水氣單胞菌為對照組,以添加0.024M、0.048M、0.072M、0.096M、0.12M碳酸氫鈉的嗜水氣單胞菌為實驗組,對嗜水氣單胞菌的三個主要毒力基因---溶血素基因(AHH-1)、氣溶素基因(AerA)和彈性蛋白酶基因(ahyB)進行相對表達分析。實驗結(jié)果表明,添加了碳酸氫鈉的嗜水氣單胞菌,其AHH-1、AerA和ahyB的表達量均顯著低于未添加碳酸氫鈉的嗜水氣單胞菌。且隨著碳酸氫鈉濃度的增加,基因表達呈逐漸下調(diào)趨勢。本實驗中,AHH-1、AerA和anyB的表達量均顯著降低,且AHH-1、AerA的表達產(chǎn)物均具有溶血活性,彈性蛋白酶能分解彈性蛋白。推測碳酸氫鈉主要是通過降低嗜水氣單胞菌的溶血活性及分解彈性蛋白的能力,進而降低了其細菌毒性。綜上所述,碳酸氫鈉對嗜水氣單胞菌的生長和毒性具有較好的抑制作用。進一步研究發(fā)現(xiàn),碳酸氫鈉可能是通過降低嗜水氣單胞菌中溶血物質(zhì)及彈性蛋白酶相關(guān)基因的mRNA表達量,進而降低其毒性。研究結(jié)果對防治嗜水氣單胞菌病具有一定的指導意義。
【圖文】：

根據(jù)1.2.1的實驗方法計算細菌的生長速率常數(shù)和代時，繪制不同碳酸氫鈉濃度與細菌生長速度指標的關(guān)系圖（見圖2-2）。圖2-1 不同濃度NaHCO3下嗜水氣單胞菌的生長曲線Fig.2-1 Growth curve of A. hydrophila in different concentration of NaHCO3圖2-2 不同濃度碳酸氫鈉下細菌的生長速率常數(shù)及代時Fig.2-2 Growth rate constant and generation time of A. hydrophila in differentconcentration of NaHCO3嗜水氣單胞菌的初始OD600值為0.030。從圖2-1可知，碳酸氫鈉濃度為0、0.024M、02468101214160 0.024 0.048 0.072 0.096 0.12碳酸氫鈉濃度（M）長速率常數(shù)生/R時代G（inm）R值 G值

106.53cfu/mL。圖2-3描述了嗜水氣單胞菌暴露在不同濃度碳酸氫鈉中的死亡率。細菌暴露在0.8M、0.4M碳酸氫鈉中達到99.5%死亡率所需要的時間分別是1h和4h，而暴露在0.2M碳酸氫鈉中6h，死亡率僅為78.4%。培養(yǎng)12h后，0.4M、0.8M碳酸氫鈉中已無細菌存活，0.2M碳酸氫鈉中只有極少數(shù)細菌存活（存活率小于0.01%）。由此可見，碳酸氫鈉濃度越高，嗜水氣單胞菌死亡率越大，死亡速度越快。圖2-3 不同濃度碳酸氫鈉中細菌的死亡率Fig.2-3 Death rate of A. hydrophila after exposure to different concentration of NaHCO3(注：空心的點表示在該時間點沒有實際測數(shù)，為方便繪圖而進行人為計算補充的數(shù)值)2.2.3 幾種無機鹽對嗜水氣單胞菌生長影響的比較從表2-1可知
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S941.4

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