【摘要】：殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌(Edwardsiella piscicida)是海水養(yǎng)殖魚(yú)類的重要病原菌,由殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌引發(fā)的愛(ài)德華氏菌病給我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。細(xì)菌非編碼小RNA是近些年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)控因子,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá),參與調(diào)控環(huán)境應(yīng)答、群體感應(yīng)(quorum sensing)、生物膜形成、運(yùn)動(dòng)性和致病性等生物學(xué)過(guò)程。目前對(duì)于殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌的感染機(jī)制,尤其是非編碼小RNA(sRNA)調(diào)控的毒力機(jī)制仍有待研究。本研究通過(guò)對(duì)不同生長(zhǎng)環(huán)境下(正常LB培養(yǎng),酸性脅迫,缺鐵脅迫和氧化脅迫)培養(yǎng)的殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌提取總RNA進(jìn)行高通量測(cè)序,總共發(fā)現(xiàn)有148個(gè)sRNA表達(dá),其中19個(gè)是已經(jīng)注釋過(guò)的sRNA,其它129個(gè)未曾報(bào)道。相比正常LB培養(yǎng)組,共有103個(gè)sRNA在3種脅迫環(huán)境下有顯著差異表達(dá)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果,分別選取在酸性條件和氧化條件下具有顯著差異表達(dá)的sRNA(命名為sR082和sR012)進(jìn)行深入研究。首先,用qRT-PCR法分析了sR082和sR012在不同生長(zhǎng)時(shí)期和不同環(huán)境脅迫壓力下的表達(dá)量,結(jié)果表明,sR082在細(xì)菌生長(zhǎng)早期和低pH條件下高表達(dá);sR012在細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期高表達(dá)。為了研究sR012和sR082生物學(xué)功能,利用同源重組法分別構(gòu)建了sR082和sR012敲除株TXΔsR082和TXΔsR012,比較敲除株和野生株在低pH壓力和氧化壓力條件下的生長(zhǎng)情況。發(fā)現(xiàn)TXΔsR082在pH 5條件下生長(zhǎng)能力顯著降低;TXΔsR012在氧化壓力條件下生長(zhǎng)能力顯著降低。這些結(jié)果表明sR082與sR012分別與細(xì)菌適應(yīng)酸性和氧化脅迫能力有關(guān)。為分析sR082與sR012對(duì)細(xì)菌感染宿主的影響,本研究分別比較了TXΔsR082,TXΔsR012與野生株TXD1感染牙鲆細(xì)胞、組織和個(gè)體能力的差異。結(jié)果表明,與TXD1相比,TXΔsR082和TXΔsR012感染牙鲆FG細(xì)胞能力、胞內(nèi)復(fù)制能力、組織侵染能力以及致死能力均顯著下降。這些結(jié)果表明,sR082和sR012在殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌耐受宿主胞內(nèi)酸性和氧化環(huán)境及感染等方面發(fā)揮重要作用。為進(jìn)一步了解sR012在殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌中的調(diào)控作用,利用TargetRNA2軟件對(duì)sR012進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),并用qRT-PCR驗(yàn)證靶基因的轉(zhuǎn)錄水平。發(fā)現(xiàn)共有4個(gè)靶基因(ETAE-0114,ETAE-2575,ETAE-3156和ETAE-0911)在TXD1和TXΔsR012中有差異表達(dá),這些結(jié)果表明sR012可能通過(guò)調(diào)控這4個(gè)靶基因適應(yīng)宿主胞內(nèi)氧化環(huán)境從而影響殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌的毒力。
【圖文】：

利用酸中和基因 gadB（谷氨酸脫羧酶）（Srinivasa et al., 2003）、抗氧化基因 KatB（過(guò)氧化氫酶）和 SodB（超氧化物歧化酶）（Cheng et al., 2010）來(lái)抵抗酸性環(huán)境和活性氧殺傷。細(xì)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活和復(fù)制時(shí)，III 型分泌系統(tǒng)蛋白 EsaC 和 EseB 表達(dá)量顯著增加，而鞭毛蛋白和溶血素蛋白 EthA 表達(dá)量顯著降低，因?yàn)榧?xì)菌在胞內(nèi)生存時(shí)不需要運(yùn)動(dòng)和侵染（Wang et al., 2011）。在感染第六步，細(xì)菌進(jìn)一步感染和復(fù)制增殖，當(dāng)細(xì)菌的數(shù)量增加到一定數(shù)量時(shí)，從局部感染擴(kuò)散至全身感染。E. tarda 在感染過(guò)程中需要攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以保證其在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和增殖。當(dāng)宿主體內(nèi)缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如磷酸鹽和鐵時(shí)，細(xì)菌可以感知，從而激活高親和力磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子 pstSCAB-phoU 和鐵載體生產(chǎn)基因 astA，增強(qiáng)其在宿主體內(nèi)的細(xì)菌毒力（Srinivasa et al., 2003）。此外，E. tarda分泌的胞外酶（如溶血素，軟骨素酶，膠原酶和蛋白酶）（Hirono et al., 1997）和T6SS 蛋白 evpP（Wang et al., 2009d）有助于細(xì)菌在全身擴(kuò)散傳播和感染。

圖 2.1 四種不同條件下 sRNA 表達(dá)的維恩圖德華氏菌 TXD1 在正常 LB 培養(yǎng)基（Con），pH 5 酸性培養(yǎng)基（Ac），100 μM啶培養(yǎng)基（Dp）和 500 μM 過(guò)氧化氫培養(yǎng)基（Pe）中培養(yǎng)。圖中的數(shù)字代表數(shù)量。Figure 2.1 Venn diagram of sRNA expression during four diferent conditionsicida TXD1 was culture in normal LB medium (Con), in LB medium with pH= 5.0ress, Ac), in LB medium with 100 μM dipyridyl (iron defciency, Dp), and in LB meith 500 μM hydrogen peroxide (oxidation pressure, Pe). The numbers inside the diaand for the numbers of sRNA.環(huán)境脅迫條件下差異表達(dá)的殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌 sRNA
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院海洋研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S941.42

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本文編號(hào)：2698864