【摘要】：弧菌(Vibrio)廣泛分布在海洋、江河和湖泊的水體中,從兩極的極冷環(huán)境到赤道的熱帶環(huán)境的水域中都有分布,隨著人們生活水平的提高,對(duì)海產(chǎn)品的需求量越來(lái)越大,弧菌已然成為了威脅水產(chǎn)養(yǎng)殖和人們的身體健康的重要病原菌,但是弧菌的種類(lèi)繁多,使在檢測(cè)和防治方面受到了巨大的挑戰(zhàn),所以建立弧菌的多重檢測(cè)和基層檢測(cè)是非常必要的。副溶血弧菌是弧菌中威脅水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要病原弧菌,每年都會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,副溶血弧菌有兩條染色體,每條染色體上各有一個(gè)不同的外膜蛋白o(hù)mpA的編碼基因,分別為VP0764和VPA1186兩段基因,取這兩段基因分別設(shè)計(jì)兩對(duì)引物,F/R引物上分別具有BamH和Sacl酶切位點(diǎn),用BL21載體進(jìn)行蛋白表達(dá),純化鑒定之后用來(lái)制備多抗,然后進(jìn)行免疫磁珠的制備進(jìn)行菌體捕捉。以副溶血弧菌的毒力因子基因(vptdh)和特異性基因(vptox)、霍亂弧菌的腸毒素基(vcctx)和外膜蛋白基因(vcomp)和溶血素基因(vchly)、擬態(tài)弧菌的溶血素基因(vmha)和特異性基因(vmtox)、創(chuàng)傷弧菌的溶血素基因(vvha)和創(chuàng)傷弧菌多重毒素基因(vvrtx)、溶藻弧菌的膠原蛋白酶基因(vacol)為目的基因設(shè)計(jì)引物和特異性微球探針,進(jìn)行液相芯片技術(shù)實(shí)驗(yàn)研究。設(shè)計(jì)的引物與五種弧菌以及大腸桿菌、沙門(mén)氏菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物與特異性探針雜交讀數(shù),證明得到液相芯片技術(shù)具有很好的特異性;特異性探針與不同菌濃度的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交,證明得到其具有很高的靈敏度;十種特異性探針?lè)謩e與單一PCR產(chǎn)物和混合PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交,證實(shí)液相芯片技術(shù)多重檢測(cè)的可操作性。搜索創(chuàng)傷弧菌溶血素A基因(hemolysin gene A,HA)和多重毒素(repeats in toxin,RTX)毒力基因的并設(shè)計(jì)兩種基因的內(nèi)、外引物,進(jìn)行LAMP檢測(cè)目的基因和人工模擬樣品,通過(guò)肉眼觀察白色沉淀,初步判斷檢測(cè)結(jié)果,再通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果。LAMP檢測(cè)兩種目的基因靈敏度達(dá)到10 CFU/ml,人工模擬樣品檢測(cè)的靈敏度分別為1×102CFU/g(VV-RTX)和1×104CFU/g(VV-HA),與普通PCR比較,具有較高的靈敏度,同時(shí)具有用時(shí)短,成本低,適合用于基層等優(yōu)點(diǎn)。
【圖文】：

＞邐黎yU？ｈ邋Ｓ邋、、邐＞＿邋＇Ｖ邋＇邐＾邐，逡逑圖１－１液相芯片檢測(cè)原理逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｌｉｑｕｉｄ邋ｃｈｉｐ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ逡逑式反應(yīng)（ＰＣＲ）技術(shù)逡逑應(yīng)（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ邋ｃｈａｉｎ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ，邋ＰＣＲ）技術(shù)在方法學(xué)上是

液相芯片技術(shù)和ＬＡＭＰ技術(shù)檢n,致病性孤菌的研究逡逑３．１目的基因擴(kuò)增結(jié)果逡逑兩個(gè)引物以提取的目的基因?yàn)槟康钠芜M(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖２－１中Ａ、Ｂ逡逑所示，經(jīng)過(guò)測(cè)序后證明，ＶＰ０７６４引物出現(xiàn)了一條與大小約為９０３邋ｂｐ的條帶，而逡逑陰性對(duì)照組沒(méi)有條帶，ＶＰＡ１１８６引物也出現(xiàn)一條大小約為９３３邋ｂｐ的條帶，而陰逡逑性對(duì)照組沒(méi)有出現(xiàn)條帶。逡逑ｂｐ邋１邐２邐３邐ｂｐ邋１邐２邐３逡逑：塞姦’邋＇逡逑：：卜邋－逡逑（Ａ）邐（Ｂ）逡逑圖２－１基因片段擴(kuò)增結(jié)果逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｇｅｎｅ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｒｅｓｕｌｔｓ逡逑注：Ａ、＼Ｔ０７６４ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果；Ｂ、ＶＰＡ１１８６ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果逡逑１、ＭａｒｋｅｒＤＬ１５０００；邋２、陽(yáng)性組；３、陰性組逡逑１邋．Ｍａｒｋｅｒ邋ＤＬ１５０００；邋２．Ｔｈｅ邋ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｇｒｏｕｐ；邋３．Ｔｈｅ邋ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｇｒｏｕｐｓ逡逑３．２質(zhì)粒構(gòu)建鑒定逡逑３．２．１菌液ＰＣＲ鑒定逡逑將ＶＰ０７６４和ＶＰＡ１１８６兩種外膜的慘敗連接轉(zhuǎn)化之后的ＢＬ２１大腸桿菌進(jìn)行逡逑培養(yǎng)之后，進(jìn)行菌液ＰＣＲ鑒定，結(jié)果如圖２－２，邋ＶＰ０７６４的引物擴(kuò)增的條帶大小逡逑和目的基因大�。梗埃冲澹猓鹣嘟�，ＶＰＡ１１８６的引物擴(kuò)增的條帶大小和目的基因條帶逡逑大�。梗常冲澹猓鹣嘟�，，陰性對(duì)照組都沒(méi)有條帶。逡逑２７逡逑
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S941.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2698427