【摘要】：鯉魚是我國(guó)重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物,黃河鯉魚是鯉魚中的一個(gè)重要的地方品種。近年來,由于人類活動(dòng)因素的影響,如過度捕撈,濫捕濫殺,河流污染,天然繁殖基地被隔離以及黃河自然斷流等,這些因素嚴(yán)重破壞著黃河流域的生態(tài)平衡,使得黃河鯉魚的資源總量急劇下降。伴隨著黃河鯉魚養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大,疾病發(fā)生頻繁,嚴(yán)重制約了黃河鯉魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展,黃河鯉魚抗病研究越來越受到重視。過氧化物還原酶(Peroxiredoxin,Prx)是抗氧化酶家族成員之一,廣泛存在于各種生物體內(nèi),能夠通過消除細(xì)胞內(nèi)的烷基過氧化氫和過氧化氫等氧化攻擊,維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡。本文以我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖魚類黃河鯉魚為實(shí)驗(yàn)材料,對(duì)黃河鯉魚典型2-Cys Prx基因中的Prx3和Prx4進(jìn)行研究,目的是闡明抗氧化蛋白Prx在黃河鯉魚免疫系統(tǒng)中的作用機(jī)制,為魚類抗病防御機(jī)制的研究提供有效的理論依據(jù)。依據(jù)NCBI中提供的鯉魚全基因組序列信息,采用RT-PCR方法,從黃河鯉魚肝臟中克隆得到Prx3和Prx4。Prx3基因組全長(zhǎng)是2816 bp,其中5,端不翻譯區(qū)(Untranslated Regions,UTR)為196 bp,開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)為753 bp,編碼250個(gè)氨基酸,推導(dǎo)其編碼蛋白的分子量是27.01kDa,理論等電點(diǎn)為8.25。Prx4基因組全長(zhǎng)是3475 bp,其中開放閱讀框?yàn)?83 bp,編碼260個(gè)氨基酸,推導(dǎo)其編碼蛋白的分子量是29.11 kDa,理論等電點(diǎn)為5.98。Prx3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)包含29.60%α-螺旋和7.20%β-折疊;Prx4二級(jí)結(jié)構(gòu)包含31.15%α-螺旋和10.77%β-折疊。對(duì)Prx3和Prx4進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn),黃河鯉魚和其他所分析的魚類均含有共同的保守催化中心“FTFVCPTEI”和“GEVCPA”。經(jīng)序列對(duì)比及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析表明黃河鯉魚Prx3和Prx4與斑馬魚、新月魚、棘魚的過氧化物還原酶基因具有非常高的同源性。轉(zhuǎn)錄水平分析顯示,Prx3和Prx4基因在黃河鯉魚的12個(gè)組織(性腺、肝臟、肌肉、鰭、魚鰾、眼、腦、鰓、脾臟、腸、腎臟、心臟)中均有表達(dá),其中Prx3在腎臟中的表達(dá)量最高,肌肉次之,在鰭中表達(dá)量最低。Prx4在腎中的表達(dá)量最高,在性腺中的表達(dá)量較低于腎臟,在魚鰾中表達(dá)量最低。腹腔注射嗜水氣單胞菌后,提取其肝,脾和腎3個(gè)組織進(jìn)行表達(dá)變化分析,發(fā)現(xiàn)在不同的時(shí)間段這3個(gè)組織Prx3和Prx4都有明顯的變化。在感染6h后,肝臟和脾臟中的Prx3和Prx4的表達(dá)量顯著增加,之后逐漸下降。在腎臟中,感染6h后Prx3和Prx4的表達(dá)量顯著下降,之后有上升趨勢(shì)。這顯示了Prx3和Prx4在黃河鯉魚遭受病原菌感染時(shí)具有較強(qiáng)的應(yīng)答水平。擴(kuò)增Prx4基因的成熟肽后,Sal I、EcoR I雙酶切擴(kuò)增片段和原核表達(dá)載體pMAL-c5x,構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒pMAL-c5x-Prx4,經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定,目的基因正確插入表達(dá)載體,將其轉(zhuǎn)入E.coli BL21中,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒菌E.coli BL21/pMAL-c5x-Prx4,SDS-PAGE檢測(cè)表明,Prx4能在E.coli BL21中以可溶性重組蛋白的形式表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物的分子量約為72kDa。Western Blot表明,Prx4蛋白在黃河鯉魚的肝臟、鰓、眼等組織中均有表達(dá)。對(duì)純化的Prx4重組蛋白進(jìn)行酶活性分析,結(jié)果表明重組蛋白Prx4在DTT存在的條件下能還原H2O2。紙片擴(kuò)散法進(jìn)一步驗(yàn)證了重組蛋白Prx4能保護(hù)大腸桿菌(BL21)細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激。本文的結(jié)果證明了Prx3和Prx4在黃河鯉魚中的表達(dá)特征和抗氧化活性。
【圖文】：

ys 型過氧化物還原酶基因的分子克隆、原核表3 結(jié)果與分析鯉魚各個(gè)組織和不同感染時(shí)間段的鯉核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè) RNA 濃度值，的污染程度較少，適合進(jìn)行下一步圖 3.1），這說明 RNA 完整無降解

這說明 RNA 完整無降圖 3.1 黃河鯉魚組織總 RNA 電泳圖譜trophoresis pattern of total RNAin Yellowx4 基因 ORF 克隆，在基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)的引基因序列，利用上述引物，經(jīng)膠電泳后，得到一條約為 75
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S917.4;Q78

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