【摘要】：鯉魚是我國重要的水產經濟動物,黃河鯉魚是鯉魚中的一個重要的地方品種。近年來,由于人類活動因素的影響,如過度捕撈,濫捕濫殺,河流污染,天然繁殖基地被隔離以及黃河自然斷流等,這些因素嚴重破壞著黃河流域的生態(tài)平衡,使得黃河鯉魚的資源總量急劇下降。伴隨著黃河鯉魚養(yǎng)殖規(guī)模的擴大,疾病發(fā)生頻繁,嚴重制約了黃河鯉魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展,黃河鯉魚抗病研究越來越受到重視。過氧化物還原酶(Peroxiredoxin,Prx)是抗氧化酶家族成員之一,廣泛存在于各種生物體內,能夠通過消除細胞內的烷基過氧化氫和過氧化氫等氧化攻擊,維持細胞內氧化還原平衡。本文以我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類黃河鯉魚為實驗材料,對黃河鯉魚典型2-Cys Prx基因中的Prx3和Prx4進行研究,目的是闡明抗氧化蛋白Prx在黃河鯉魚免疫系統(tǒng)中的作用機制,為魚類抗病防御機制的研究提供有效的理論依據(jù)。依據(jù)NCBI中提供的鯉魚全基因組序列信息,采用RT-PCR方法,從黃河鯉魚肝臟中克隆得到Prx3和Prx4。Prx3基因組全長是2816 bp,其中5,端不翻譯區(qū)(Untranslated Regions,UTR)為196 bp,開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)為753 bp,編碼250個氨基酸,推導其編碼蛋白的分子量是27.01kDa,理論等電點為8.25。Prx4基因組全長是3475 bp,其中開放閱讀框為783 bp,編碼260個氨基酸,推導其編碼蛋白的分子量是29.11 kDa,理論等電點為5.98。Prx3蛋白的二級結構包含29.60%α-螺旋和7.20%β-折疊;Prx4二級結構包含31.15%α-螺旋和10.77%β-折疊。對Prx3和Prx4進行同源性分析發(fā)現(xiàn),黃河鯉魚和其他所分析的魚類均含有共同的保守催化中心“FTFVCPTEI”和“GEVCPA”。經序列對比及系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析表明黃河鯉魚Prx3和Prx4與斑馬魚、新月魚、棘魚的過氧化物還原酶基因具有非常高的同源性。轉錄水平分析顯示,Prx3和Prx4基因在黃河鯉魚的12個組織(性腺、肝臟、肌肉、鰭、魚鰾、眼、腦、鰓、脾臟、腸、腎臟、心臟)中均有表達,其中Prx3在腎臟中的表達量最高,肌肉次之,在鰭中表達量最低。Prx4在腎中的表達量最高,在性腺中的表達量較低于腎臟,在魚鰾中表達量最低。腹腔注射嗜水氣單胞菌后,提取其肝,脾和腎3個組織進行表達變化分析,發(fā)現(xiàn)在不同的時間段這3個組織Prx3和Prx4都有明顯的變化。在感染6h后,肝臟和脾臟中的Prx3和Prx4的表達量顯著增加,之后逐漸下降。在腎臟中,感染6h后Prx3和Prx4的表達量顯著下降,之后有上升趨勢。這顯示了Prx3和Prx4在黃河鯉魚遭受病原菌感染時具有較強的應答水平。擴增Prx4基因的成熟肽后,Sal I、EcoR I雙酶切擴增片段和原核表達載體pMAL-c5x,構建獲得重組質粒pMAL-c5x-Prx4,經酶切和測序鑒定,目的基因正確插入表達載體,將其轉入E.coli BL21中,構建重組表達質粒菌E.coli BL21/pMAL-c5x-Prx4,SDS-PAGE檢測表明,Prx4能在E.coli BL21中以可溶性重組蛋白的形式表達,表達產物的分子量約為72kDa。Western Blot表明,Prx4蛋白在黃河鯉魚的肝臟、鰓、眼等組織中均有表達。對純化的Prx4重組蛋白進行酶活性分析,結果表明重組蛋白Prx4在DTT存在的條件下能還原H2O2。紙片擴散法進一步驗證了重組蛋白Prx4能保護大腸桿菌(BL21)細胞抵抗氧化應激。本文的結果證明了Prx3和Prx4在黃河鯉魚中的表達特征和抗氧化活性。
【圖文】：

ys 型過氧化物還原酶基因的分子克隆、原核表3 結果與分析鯉魚各個組織和不同感染時間段的鯉核酸蛋白測定儀檢測 RNA 濃度值，的污染程度較少，適合進行下一步圖 3.1），這說明 RNA 完整無降解

這說明 RNA 完整無降圖 3.1 黃河鯉魚組織總 RNA 電泳圖譜trophoresis pattern of total RNAin Yellowx4 基因 ORF 克隆，在基因的保守區(qū)域設計的引基因序列，利用上述引物，經膠電泳后，得到一條約為 75
【學位授予單位】：山東農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4;Q78

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本文編號：2697090