【摘要】：鑒于溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)對漁業(yè)生產的嚴重影響,研發(fā)抵抗該菌感染的疫苗成為目前迫切的需要。而在水產養(yǎng)殖中乳酸菌作為益生菌能改善養(yǎng)殖的水環(huán)境、促進養(yǎng)殖動物腸道內微生物平衡、提高其抗病力等。本研究擬結合益生菌和疫苗的長處,從健康石斑魚腸道中分離鑒定乳酸菌,并將溶藻弧菌免疫保護原基因VscO通過分子生物學技術插入至乳酸菌構建組成型重組乳酸菌株,并對該組成型重組乳酸菌株的生物學特性、安全性和免疫保護等進行了研究。其結果如下:1、從健康的珍珠龍膽石斑魚中分離得到3株乳酸菌ZJS01-ZJS03,結合生理生化方法以及分子生物學手段鑒定3株乳酸菌都為乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。安全性檢測表明三株乳酸乳球菌均為安全性菌株;藥敏試驗結果表明三株菌株均對氨基糖類、喹諾酮類多數(shù)、復方新諾明、多念菌素B和氨曲南表現(xiàn)為耐藥,對青霉素類多數(shù)、四環(huán)素類、大環(huán)內脂類及克林霉素、氯霉素敏感和頭孢類抗生素表現(xiàn)為敏感;細菌拮抗結果表明三株乳酸菌均對大腸桿菌(E.coli DH5α)無抑制作用,對溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈氏弧菌(Vibrio harnyi)和嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)都有較顯著的抑制作用,其中對溶藻弧菌和副溶血弧菌抑菌效果最好,抑菌直徑為21.5-23.5 mm。2、通過分子生物學技術將溶藻弧菌HY9001株Vsco基因,構建了能表達Vsco基因組成型重組乳酸菌Lc-pMG36e-Vsco;Western blotting驗證Vsco基因在乳酸乳球菌中的表達情況,結果表明,重組的乳酸乳球菌能表達出約18 kDa VscO蛋白,并且具有良好的反應原性;質粒遺傳穩(wěn)定性結果表明:連續(xù)培養(yǎng)45代后,質粒遺傳特性穩(wěn)定。3、為了檢驗構建好的乳酸菌能否能誘導腸道黏膜和系統(tǒng)免疫應答,將組成型重組乳酸菌Lc-pMG36e-Vsco包被于顆粒餌料投喂珍珠龍膽石斑魚(Pearl gentian grouper),ELISA檢測各組石斑魚血清樣品中特異性IgM抗體、ACP、SOD以及Lysozyme活性水平,結果表明,對比對照組,重組乳酸菌組中所有石斑魚血清中IgM抗體、ACP、SOD和Lysozyme活性水平顯著增高。通過實時熒光定量PCR的方法檢測相關組織中的IL-1β、IL-10、TNF-α和MHC-1α免疫基因表達水平變化,結果表明,雖然野生菌株也均能顯著加強石斑魚主要免疫器官頭腎和脾臟中IL-1β、IL-10、TNF-α和MHC-1α基因的轉錄水平,但重組菌株組中上述免疫基因表達水平顯著高于野生菌株組(P0.05),從而提高石斑魚的免疫保護力和抗病能力。4、對上述投喂組成型重組乳酸菌Lc-pMG36e-Vsco的石斑魚用溶藻弧菌強毒株HY9901腹腔注射進行攻毒實驗,結果表明重組菌株和野生菌株都能緩解病原菌的感染,具有一定的保護作用,重組菌株的免疫保護率達到68%,重組菌株的免疫效果高于野生菌株組(55%)。總之,本研究構建表達溶藻弧菌Vsco基因的重組乳酸菌Lc-pMG36e-Vsco,經口服免疫珍珠龍膽石斑魚后能刺激機體產生特異性IgM抗體和相關酶類,并能促進機體內相關細胞因子的表達,提高了機體的體液免疫應答和增強機體的免疫力,為研發(fā)口服乳酸菌或乳酸菌活載體疫苗的應用提供了依據(jù)。
【圖文】：

乳酸乳球菌的分離及作為溶藻弧菌 DNA 疫苗投遞載體的研究菌株均能在 28 ℃、32 ℃、37 ℃及含 0%、2%、4%、8% NaCl MRS 液體培養(yǎng)中生長。2.3.2 分離菌的生化特征和 16s rRNA利用傳統(tǒng)方法和乳酸菌鑒定試劑條對 9 株乳酸菌的生理生化特性分析（表 1）。結果表明，ZJS01、ZJS02、ZJS03 三者菌株生理生化特征完全一致性，與乳酸乳球菌(NZ9000)標準菌株相同，比如過氧化氫酶、葡萄糖產氣試驗、明液化試驗和產 H2S 試驗結果均為陰性；石蕊牛奶試驗、葡萄糖產酸試驗、葡聚產生試驗、精氨酸水解試驗和 V-P 試驗結果均為陽性。糖發(fā)酵鑒定結果可知株菌株均能發(fā)酵七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、甘露糖、水楊苷、蔗糖、菊糖和糖，，不能發(fā)酵山梨醇和棉籽糖。由上述結果初步判斷 3 株菌株為乳酸菌（表 2.通過 16s rRNA 結果發(fā)現(xiàn) 3 株分離菌株均為乳酸乳球菌（圖 2.1）。

ZJS01- ZJS03 都和乳酸乳球菌有很高的同源性，高達 98%-99%（圖2.2），由此可知，分離得到的三株乳酸菌均與乳酸乳酸菌聚為一支。2.3.4 安全性評價通過口腔灌胃乳酸乳球菌到珍珠龍膽石斑魚體內，用商品化石斑魚飼料投喂，經過一段時間的觀察結果發(fā)現(xiàn)，魚體并無出現(xiàn)異常行為且均存活，說明了該分離得到的乳酸乳球菌時安全的，可用于作為后續(xù)實驗。2.3.5 抗生素敏感性根據(jù) WHO 提供的 NCCLS (clinical and laboratory standards institute)最新版本對敏感或耐藥的判斷標準，分析 3 株乳酸菌對 7 大類 34 種抗生素的藥敏結果(表2.2)。試驗結果表明，3 株乳酸菌均對頭孢唑啉、氨芐西林、青霉素 G、哌拉西啉、米諾環(huán)素、克林霉素、四環(huán)素、克拉霉素、紅霉素和氯霉素敏感，此外，對頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢西叮、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢噻吩、萬古霉素、苯唑西林、大觀霉素、氧氟沙星、左氟沙星也表現(xiàn)為敏感,圖 2.2 基于 16S rRNA 序列構建的系統(tǒng)進化樹Fig. 2.2 Phylogenetic tree of golden pompano bacterial isolates and otherStreptococcus species reference strains from GenBank, based on the16SrRNAgene
【學位授予單位】：廣東海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S941.4

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本文編號：2697001