【摘要】：轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)是一種多功能的細(xì)胞因子,在多種細(xì)胞的生長、分化和免疫功能中起著重要作用。本試驗(yàn)采用PCR、生物信息學(xué)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、原核表達(dá)、蛋白純化和液相質(zhì)譜檢測等技術(shù)方法對鯽魚TGFβ1基因結(jié)構(gòu)特征、表達(dá)調(diào)控以及TGFβ1蛋白在鯽魚體內(nèi)的功能進(jìn)行探究。主要結(jié)果如下:獲得鯽魚TGFβ1基因cDNA序列的CDS區(qū)序列長1134 bp,共編碼377個(gè)氨基酸,具有由22個(gè)氨基酸構(gòu)成的信號肽,在胞外表達(dá)不屬于跨膜蛋白,氨基酸序列上的第280個(gè)氨基酸到第376個(gè)氨基酸可形成TGFβ樣結(jié)構(gòu)域,在魚類中較為保守,與哺乳動(dòng)物在進(jìn)化關(guān)系上距離較遠(yuǎn)。鯽魚TGFβ1基因?qū)?fù)合益生菌的應(yīng)答顯示:與不添加益生菌的對照組(A)相比,在第30 d時(shí)TGFβ1在添加沼澤紅假單胞菌組(B)、添加沼澤紅假單胞菌+枯草芽孢桿菌組(C)和添加沼澤紅假單胞菌+枯草芽孢桿菌+屎腸球菌組(D)心臟、肌肉、肝臟中的表達(dá)量極顯著上升(P0.01),在第20 d時(shí)TGFβ1在B組肌肉中表達(dá)上調(diào)極顯著(P0.01)。TGFβ1下游通路基因TAK-1、SMAD2、SMAD3、SMAD7的檢測結(jié)果顯示:與對照組A相比,在30 d時(shí)TAK-1在B組肌肉中表達(dá)量極顯著降低(P0.01),在20 d時(shí)SMAD2、SMAD3、SMAD7在B組肌肉中表達(dá)量極顯著升高(P0.01)。成功構(gòu)建表達(dá)載體TGFβ1-pDE2,SDS-PAGE電泳顯示獲得大小約為43 kDa的目的蛋白,純化后蛋白定量濃度為641.42μg/mL,液相質(zhì)譜檢測表達(dá)蛋白為TGFβ1蛋白,肽段評分856,序列覆蓋率為50%。表達(dá)出的TGFβ1蛋白具有一定的活性與功能。血清學(xué)指標(biāo)結(jié)果顯示,與注射PBS鯽魚對照組(S1)相比,在24 h時(shí)注射TGFβ1蛋白鯽魚組(S2)和灌食TGFβ1蛋白鯽魚組(S3)的堿性磷酸酶和溶菌酶活力極顯著上升(P0.01),S2組超氧化物歧化酶活力在36 h時(shí)極顯著上升(P0.01)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測顯示,與對照組S1相比,在24 h時(shí)S2組和S3組的HSP 30和HSP 47在心臟中表達(dá)量極顯著升高(P0.01),IL-11在心臟中表達(dá)量極顯著下降(P0.01)。這表明TGFβ1對鯽魚免疫機(jī)能可能具有一定促進(jìn)作用。
【圖文】：

圖 1-1 TGFβ 在肝臟中的作用[63]Fig 1-1 TGFβ roles in liver1.3 TGFβ 信號通路在脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中，TGFβ 信號途徑參與其胚胎內(nèi)中胚層的形成、胚胎體軸圖式的形成、胚胎神經(jīng)發(fā)育等[65-67]。TGF/Smad 信號通路作為經(jīng)典調(diào)節(jié)的信號通路，已經(jīng)廣泛的被研究�，F(xiàn)有研究表明，Smads 以調(diào)控蛋白的形式來將TGFβ 與細(xì)胞膜表面受體形成的信號介導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行調(diào)控[68]。TGFβ 除了可以通過 Smad 信號傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞外，一些非 Smad 信號傳導(dǎo)途徑可以通過其他方式對下游細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)。比如 TGFβ 可以與 p38 MAPK 以及 JNK 形成非經(jīng)典信號通路[69, 70]。Zhou J 等[71]在小鼠上的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn) TGFβ 誘導(dǎo)激活的 TAK1 可以對 p38 進(jìn)行更高水平的磷酸化，激活 p38 MAPK 通路來參與腎小管上皮細(xì)胞的凋亡與纖維化水平。TGFβ 受體通過調(diào)節(jié) TRAF6 來介導(dǎo) TAK1 的活化進(jìn)而介導(dǎo)

鯽魚 TGFβ1 基因的克隆及蛋白功能初探p38 MAPK 和 JNK 的激活。TGFβ/Wnt 信號傳導(dǎo)途徑對器官形成中的各組細(xì)胞著重要的影響[72]。TGFβ/Nodal 信號通路影響著斑馬魚背腹分化過程[67]。研究現(xiàn)骨形態(tài)形成蛋白（BMP）信號、Nodal 信號調(diào)控斑馬魚胚胎背腹分化都是通TGFβ 信號通路來實(shí)現(xiàn)的[73, 74]。此外，TGFβ 信號通路與 PI3K 通路、NF-κB 通等存在著相互協(xié)同的關(guān)系[70]。
【學(xué)位授予單位】：西南民族大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S917.4

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本文編號：2696844