【摘要】：集約化水產養(yǎng)殖模式下,養(yǎng)殖魚類常出現(xiàn)肝脂質代謝紊亂等問題,作為世界上養(yǎng)殖產量較大的淡水魚類,草魚(Ctenopharyngodon idella)養(yǎng)殖普遍采用投喂配合飼料的精養(yǎng)模式,其營養(yǎng)需要及配方技術的研究雖已深入開展,但生產中仍經常出現(xiàn)與飼料有關的糖脂代謝失調及肝脂質代謝紊亂問題,已嚴重影響到草魚品質。本研究以高糖高脂飼料誘導的草魚脂肪肝為材料,通過高通量測序技術,篩選出差異表達的mi RNAs;利用mi RNAs預測軟件,預測魚類脂代謝特異mi RNAs的靶基因;利用q RT-PCR技術檢測草魚脂代謝相關基因SREBP-1、PPARγ、ACC1、FAS、LPL、CPT-1的表達變化,并對篩選出的脂代謝相關mi R-33的靶基因進行初步驗證,以期闡明關鍵mi RNAs調節(jié)草魚肝脂代謝紊亂的作用機制。本研究從篩選調節(jié)肝脂代謝的關鍵mi RNAs入手,探討魚類肝臟脂肪代謝的標志基因和mi RNAs的差異變化,旨在豐富魚類糖脂代謝理論,為提高草魚脂代謝利用能力、防治脂肪肝等營養(yǎng)代謝疾病、促進草魚健康養(yǎng)殖提供新的思路。1、高糖高脂飼料誘導草魚脂肪肝形成為探討投喂高糖高脂飼料對草魚肝臟脂肪蓄積的影響,本研究設計了4種等氮但糖脂含量水平不等的飼料,對照組(糖含量31%,脂肪含量4%)、高脂組(糖含量31%,脂肪含量8%)、高糖組(糖含量45%,脂肪含量4%)和高糖高脂組(糖含量45%,脂肪含量8%),用試驗飼料飼喂草魚65天后,檢測草魚生長指標、飼料效率、蛋白質效率及肝脂含量,對草魚是否形成脂肪肝進行初步判斷。結果表明,草魚在攝食高糖高脂飼料后,其生長性能、飼料效率、蛋白質效率與對照組相比無顯著差異(P0.05);草魚的肝體比(HSI)、臟體比(VSI)與對照組相比也無顯著變化(P0.05);高糖高脂組的腸脂比(MFI)顯著高于對照組(P0.05),高糖組、高脂組與對照組之間無顯著差異(P0.05);高糖組、高脂組和高糖高脂組的肝脂含量均顯著高于對照組(P0.05),說明高糖高脂飼料對草魚生長影響不大,但引起了草魚肝臟脂肪的大量蓄積。用全自動生化分析儀(AU-640,OLYMPUS)檢測血清中甘油三酯(Triglyceride,TG)、谷丙轉氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、球蛋白(Globulin,GLB)、總蛋白(Total protein,TP)等生化指標,結果發(fā)現(xiàn)在高糖高脂飼料誘導下,與對照組相比,AST/ALT、GLB、TP、TG等指標升高,說明肝臟功能已受到了一定影響,其中以高糖高脂組受到的損害最嚴重。顯微鏡下觀察肝臟組織學形態(tài),結果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,高糖組、高脂組和高糖高脂組的肝細胞內脂滴明顯增多,有的細胞腫大變形,說明高糖高脂誘導不僅導致了肝臟脂肪的大量蓄積,還可能引起了肝臟功能的部分損傷。2、高通量測序技術篩選高糖高脂飼料誘導下差異表達的mi RNAs飼喂試驗結束后,提取并分離草魚肝臟小RNA,構建小RNA文庫,采用Hiseq深度測序技術,篩選出高糖高脂誘導下差異表達的mi RNAs。結果表明,與對照組相比,高糖組、高脂組、高糖高脂組分別有531、455和637個差異表達的mi RNAs,并初步確定了18個新的mi RNAs。3、熒光定量檢測高糖高脂對脂代謝基因和mi RNAs表達的影響以誘導的草魚肝為材料,實時熒光定量技術檢測6種脂代謝相關基因和3種mi RNAs在不同處理下的表達量,結果顯示,脂肪生成轉錄因子SREBP-1、PPARγ和脂肪生成酶基因ACC1、FAS的表達量均上調,脂蛋白脂酶基因LPL表達量也上調,脂肪氧化酶基因CPT-1表達量下調,說明高糖高脂誘導下,可引發(fā)脂代謝相關基因的表達響應。3種mi RNAs(mi R-33、mi R-122、mi R-370)的表達均顯著上調,與高通量測序結果一致。推測mi RNAs與糖脂代謝相關基因可能共同參與調節(jié)草魚糖脂代謝過程。4、草魚SREBP-1基因的克隆及mi R-33靶基因的預測固醇調節(jié)元件結合蛋白(SREBPs)是調控糖脂代謝相關基因表達的關鍵核轉錄因子。為獲知草魚SREBP-1基因的序列,本實驗采用同源克隆和RACE的方法獲得了草魚SREBP-1的部分c DNA序列,并通過生物信息學方法對該基因及所編碼蛋白的結構特征進行了分析;利用實時熒光定量PCR的方法,對SREBP-1在8種不同組織中的表達規(guī)律進行了研究,利用mi RNAs預測軟件預測了mi RNAs在SREBP-1 3'非編碼區(qū)的作用靶位點。結果顯示:草魚SREBP-1的c DNA長為4760 bp(Gen Bank登錄號:KJ162572),其中開放讀碼框為3426 bp,編碼1141個氨基酸;3'非編碼區(qū)為1279 bp;草魚SREBP-1具有一個典型的堿性螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈結構(b HLH-zip);氨基酸序列比對結果顯示,草魚SREBP-1與其他魚類的同源性達到76%-88%之間,與斑馬魚的進化關系最近;草魚SREBP-1基因在腦中的表達量最高,肝臟和腸次之,在脾臟、腎臟、脂肪、肌肉和性腺中均有少量表達;mi RNAs靶基因預測結果顯示,SREBP-1的3'UTR區(qū)存在兩種與脂代謝相關的mi RNAs,即mi R-33和mi R-16。5、SREBP-1基因3'-UTR雙熒光素酶報告載體的構建本研究成功構建了SREBP-1 3'UTR熒光素酶報告基因載體,并驗證了SREBP-13'UTR區(qū)包含了mi R-33的結合位點,是mi R-33的候選靶基因。為下一步在細胞水平上對mi R-33的功能和作用機理進行研究奠定了基礎。
【學位授予單位】：河南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 明璽;吳玲玲;陳玲;李建華;趙建夫;;林丹短期暴露下的斑馬魚(Brachydanio rerio)組織學變化[J];生態(tài)毒理學報;2006年03期

2 蔣利和;吳宏玉;黃凱;麻艷群;楊淇齡;余德光;鐘靈香;;飼料糖水平對吉富羅非魚幼魚生長和肝代謝功能的影響[J];水產學報;2013年02期

相關碩士學位論文 前1條

1 劉芳;黃斑藍子魚固醇調節(jié)元件結合蛋白-1基因克隆及表達研究[D];汕頭大學;2011年

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本文編號：2696717