【摘要】：傳染性造血器官壞死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)感染鮭科魚類可引起造血器官壞死,IHNV高致病力毒株對(duì)鮭鱒幼魚的致死率高達(dá)90%以上。此病廣泛流行于北美、歐洲、亞洲的各國(guó),已成為世界鮭鱒魚類養(yǎng)殖業(yè)的重要疫病之一。宿主的天然免疫應(yīng)答是抵抗病毒感染的第一道防線,而激活NF-κB信號(hào)通路是宿主發(fā)揮抗病毒作用的重要機(jī)制之一。本研究篩選影響NF-κB信號(hào)通路的IHNV相關(guān)蛋白,研究其對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制,為探討IHNV的致病機(jī)理提供了科學(xué)數(shù)據(jù)。通過(guò)NF-κB熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)IHNV感染細(xì)胞后對(duì)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性的影響和篩選影響NF-κB活性的IHNV的蛋白。結(jié)果表明:IHNV感染CHSE-214和EPC細(xì)胞均可激活NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性,L蛋白激活NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性,NV蛋白抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性,且L蛋白對(duì)NF-κB的激活作用強(qiáng)于NV蛋白對(duì)NF-κB的抑制作用。為研究NV蛋白對(duì)NF-κB信號(hào)通路抑制作用的分子機(jī)制,以NV的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,檢測(cè)p65的磷酸化、轉(zhuǎn)定位及IκBα與NF-κB下游炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。結(jié)果表明:NV蛋白抑制IκBα的降解及p65的磷酸化和入核,抑制IL-1、IL-8、IL-17、SAA炎癥因子的表達(dá);NV基因的第32-35位類核定位信號(hào)位點(diǎn)(32EGDL35)對(duì)抑制NF-κB起關(guān)鍵作用。通過(guò)重疊延伸PCR方法將親本毒株wt IHNV HLJ-09 NV基因第32-35位氨基酸突變?yōu)楸彼峄蛘呷笔н@4位氨基酸,拯救出NV(32EGDL35)位點(diǎn)缺失的重組病毒,通過(guò)感染CHSE-214細(xì)胞、RT-PCR鑒定、分子標(biāo)識(shí)的鑒定、電鏡觀察及間接免疫熒光檢測(cè)鑒定,獲得重組病毒rIHNV-NVT32-35和rIHNV-NVβ32-35。重組病毒感染CHSE-214細(xì)胞后NF-κB發(fā)生核轉(zhuǎn)移,表明NV蛋白抑制p65的核轉(zhuǎn)移,且第32-35位氨基酸起重要作用。重組病毒的生物學(xué)特性研究表明:rIHNV-NVQ32-35和rIHNV-NVT32-35在CHSE-214細(xì)胞上的復(fù)制能力均低于親本毒株wtIHNVHLJ-09,說(shuō)明同時(shí)突變NV蛋白第32-35位四個(gè)氨基酸時(shí)會(huì)降低病毒的復(fù)制能力。對(duì)虹鱒稚魚致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示:wtIHNVHLJ-09、rIHNV-NVQ32-35和rIHNV-NVT32.35.rIHNV-ANV-EGFP感染組分別在感染后第4天、第6天和第10天出現(xiàn)死亡,死亡高峰分別出現(xiàn)在第 6～8 天、第 7～10 天和未出現(xiàn),wtIHNVHLJ-09、rIHNV-NVQ32-35 和 rIHNV-NVT32-35,rIHNV-ANV-EGFP感染組20天的累積死亡率分別是90%、55%、60%和10%。感染后同一時(shí)間虹鱒臟器病理變化可見rIHNV-△NV-EGFP、rIHNV-NVQ32-35、rIHNV-NVT32-35組僅能引起肝臟、心臟組織的病變,損傷程度低于親本病毒wt IHNV HLJ-09感染組,一定程度上也反映了重組病毒的致病性要明顯低于親本毒株。通過(guò)熒光定量PCR方法檢測(cè)虹鱒稚魚感染病毒后細(xì)胞因子表達(dá)和肝、腎組織中的病毒含量,結(jié)果表明IHNVNV32EGDL35位點(diǎn)對(duì)抑制IFN1、Mx-1和IL-6的表達(dá)起著重要作用,與親本毒wtIHNVHLJ-09相比,感染重組病毒的肝臟和腎臟組織病毒拷貝數(shù)均不同程度的降低,可見NV基因全部缺失或第32-35位四個(gè)氨基酸聯(lián)合突變時(shí),其復(fù)制能力不同程度的降低,且病毒毒力亦減弱。
【圖文】：

圖１－３邋ＮＦ－ｋＢ激?

分別將不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，利用ＩＦＡ和ＷＢ測(cè)定了各個(gè)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果表明，編碼逡逑ＩＨＮＶＮ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、ＮＶ和Ｌ蛋白的所有質(zhì)粒在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ＣＨＳＥ－２１４細(xì)胞均有不同程度的表逡逑達(dá)，，表達(dá)結(jié)果如圖３－５、３－６所不。逡逑ｐＣｌ－Ｎ邐ｐＣＩ－Ｐ邐ｐＣＩ－Ｍ逡逑ＨＨＨ逡逑ｐＣＩ－Ｇ邐ｐＣＩ－ＮＶ邋ｐＣＩ－Ｌ逡逑ｍｍｍ逡逑ｐＣＩ邐Ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑■■逡逑閣３－５丨ＨＮＶ蛋白表達(dá)的驗(yàn)證逡逑Ｆｉｇ．３－５邋Ａｌｌ邋ＩＨＮＶ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｗｅｒｅ邋ｖｅｒｉｆｉｅｄ邋ｂｙ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｂｙ邋ｉｎｄｉｒｅｃｔ逡逑ｉｍｉｎｕｎｏＨｕｏｒｅｓｃｃｎｃｃ逡逑？邐３７邐？逡逑
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S941.41

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本文編號(hào)：2696622