【摘要】：微生物作為自然生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分,在動物體,植物體、及其他自然環(huán)境中普遍存在,其對于維持自然環(huán)境的生態(tài)平衡和宿主的生理功能具有重要意義。因此,關(guān)于環(huán)境微生物多樣性及其功能的研究已經(jīng)成為微生物學(xué)的研究熱點(diǎn)。由于常規(guī)培養(yǎng)技術(shù)的限制,目前在自然生態(tài)系統(tǒng)的各個(gè)環(huán)境中可用于分離培養(yǎng)的微生物不足1%,因此不依賴于分離培養(yǎng)的分子生物學(xué)方法在環(huán)境微生物學(xué)研究中得到了廣泛的應(yīng)用。然而,目前此類方法的研究重點(diǎn)大多局限于環(huán)境微生物類群多樣性的分析,而對與環(huán)境或宿主功能直接相關(guān)的特定功能菌群的挖掘與分析還相對較少。因此,為了更好地探究高通量測序技術(shù)在功能微生物挖掘分析方面的應(yīng)用效果,本文首先通過采用高通量測序技術(shù)對動物腸道益生菌群中細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4高變區(qū)和冬蟲夏草中真菌rRNA基因ITS2區(qū)進(jìn)行測序分析;然后,結(jié)合對對蝦腸道細(xì)菌菌群的分析結(jié)果及對蝦白斑綜合癥病毒的研究現(xiàn)狀,對對蝦腸道細(xì)菌菌群進(jìn)行了分離,同時(shí)篩選合適的載體啟動子,以從對蝦腸道內(nèi)分離到的優(yōu)勢菌群腸桿菌作為載體菌株進(jìn)行對蝦白斑綜合癥病毒細(xì)菌載體疫苗的構(gòu)建。主要研究結(jié)果如下:(1)采用高通量測序技術(shù)對羊糞樣品中的芽孢桿菌(Bacillus)、梭菌(Clostridium)和雙歧桿菌(Bifidobacterium)進(jìn)行屬水平測序分析,測序得到了大量的目的菌群序列,在97%的相似水平上將其歸類得到1922~63172不等的OTUs,樣品覆蓋率分別為0.89、0.99和1.00,Bacillus(芽孢桿菌屬)(37.90%)、Clostridium(梭菌屬)(52.50%)和Bifidobacterium(雙歧桿菌屬)(99.32%)均被檢測出來且為主要的優(yōu)勢菌群。(2)對冬蟲夏草蟲體和子座中的真菌類群進(jìn)行高通量測序分析得到了大量的目的菌群序列,在97%的相似水平上將其歸類得到75~187不等的OTUs,樣品覆蓋率均為1.00。在蟲體和子座中存在大量的共有菌群和各自特有菌群,Ophiocordyceps(線孢蟲草菌屬)(61.51%、5.30%)和Mortierella(被孢霉屬)(26.86%、5.91%)為主要優(yōu)勢共有菌群,此外Tolypocladium(彎頸霉屬)、Paecilomyces(擬青霉屬)和Metarhizium(綠僵菌屬)等也被檢測出來并大多為共有菌群。(3)根據(jù)上述高通量測序技術(shù)在不同樣品中微生物類群的分析效果,結(jié)合對蝦腸道細(xì)菌的高通量測序結(jié)果顯示γ變形菌綱的Enterobacteriaceae(腸桿菌科)(85%)類細(xì)菌是對蝦各個(gè)生長時(shí)期的腸道主要優(yōu)勢細(xì)菌,本實(shí)驗(yàn)對其腸道細(xì)菌進(jìn)行了分離培養(yǎng),結(jié)果表明分離到的腸道細(xì)菌有81%歸屬于腸桿菌科。(4)通過采用四種不同的鐵調(diào)控型啟動子(fur promoter)與噬菌體PhiX174裂解酶基因E(lysis E)進(jìn)行基因重組與蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示,本次實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的細(xì)菌菌蛻疫苗及載體啟動子的篩選未達(dá)到預(yù)期的結(jié)果,需要進(jìn)一步篩選影響特定毒力蛋白表達(dá)的啟動子。(5)結(jié)合對對蝦腸道優(yōu)勢菌群的分析分離結(jié)果以及合適啟動子的篩選結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)選用組成型啟動子J23100、丁香假單胞菌冰核蛋白N端基因序列inaK-N和對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)的囊膜蛋白VP28基因序列進(jìn)行重組構(gòu)建表達(dá)載體pJIVP28,以從對蝦腸道中分離到的優(yōu)勢腸桿菌為載體菌株構(gòu)建WSSV載體疫苗,結(jié)果顯示該重組表達(dá)載體構(gòu)建成功,WSSVVP28 ELISA試劑盒也檢測出重組蛋白表達(dá)并具有良好的活性,并且在宿主菌中也穩(wěn)定表達(dá)。綜上所述,本論文的結(jié)果表明:在動物腸道中存在大量的功能菌群,采用特異性測序分析方法有助于對其進(jìn)行深度挖掘和開發(fā);冬蟲夏草的自然資源枯竭,人工種植難度較大,以往研究中僅用一種菌導(dǎo)致蟲草子實(shí)體培養(yǎng)失敗,通過對比蛹蟲草中Cordyceps(蟲草菌屬)(99%)測序結(jié)果可以推斷蟲草子實(shí)體的形成很可能由兩種菌共同形成的,這對于蟲草菌的分離培養(yǎng)及人工種植具有重要意義;對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)是一種腸道感染病毒,通過分析對蝦不同生長時(shí)期的腸道菌群變化,對其優(yōu)勢菌群進(jìn)行分離培養(yǎng),并以此作為載體菌株構(gòu)建相關(guān)載體疫苗對對蝦類水產(chǎn)動物養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展具有重要意義。
【圖文】：

6圖 1-1 中國株白斑桿狀病毒基因組示意圖[51]Fig.1-1 Circular representation of the WSBV genome from China[51]1.3.5WSSV 的蛋白質(zhì)組學(xué)作為病毒結(jié)構(gòu)中重要的組成成分，病毒蛋白不僅能維持病毒基本構(gòu)型、保護(hù)病毒的核酸物質(zhì)，還能在病毒入侵細(xì)胞的過程中對組織和細(xì)胞進(jìn)行識別、吸附和侵入。根據(jù)病毒蛋白的功能將其分為結(jié)構(gòu)蛋白（主要包括核衣殼蛋白、囊膜蛋白和被膜蛋白）和非結(jié)構(gòu)蛋白[56]。通過采用病毒全基因組序列信息及蛋白質(zhì) N 端測序[57-59]等蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，到目前為止已經(jīng)鑒定的蛋白有 40 多種[59,60]，其中包括23個(gè)囊膜蛋白和9個(gè)核衣殼蛋白[61]（如下表1-1），主要核衣殼蛋白有VP15、

次之；在科分類層級上，（芽孢桿菌科）（41.27%（7.05%）、Paenibacillaceae科）（0.13%）次之；在能夠歸類到Lysinibacillus （賴氨酸芽孢桿菌屬）（屬）（14.80%）， Bifidobacterium芽孢桿菌屬）（1.40%）,（蘇黎世桿菌屬）（0.10%廣東藥科大學(xué)碩士研究生畢業(yè)論文Planococcaceae（游動球菌科）（47.45%）和）為主要優(yōu)勢科類，Bifidobacteriaceae（雙歧桿菌科）（類芽孢桿菌科）（1.23%）和 Clostridiaceae）次之；在能夠歸類到屬的 OTUs 中，Bacillus（芽孢桿菌屬）（15.60%），Sporosarcina（芽孢八疊球菌（雙歧桿菌屬）（5.80%）, SolibacillusPaenibacillus（類芽孢桿菌屬）（1.20%），）和 Clostridium（梭菌屬）（0.1%）（圖 2Bacillaceae（梭菌37.90%），，（土壤Turicibacter2-1，圖 2-2）。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S945.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2695808