【摘要】：對(duì)蝦白斑綜合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)是養(yǎng)殖蝦主要病原之一,WSSV不同地理株的變異可能導(dǎo)致WSSV毒力的變化,本論文針對(duì)2013-2015年我國主要對(duì)蝦養(yǎng)殖區(qū)WSSV變異進(jìn)行分析,同時(shí)分析了不同毒力WSSV感染凡納濱對(duì)蝦mi RNA的差異表達(dá)。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:第一章:為了了解中國不同地區(qū)白斑綜合征病毒的流行變異情況,本研究取用2013年3 12月從7個(gè)省市發(fā)病地區(qū)采集到的64份WSSV陽性樣本,以特異的引物擴(kuò)增目的片段,通過測(cè)序分析不同樣本的缺失及變異差異。結(jié)果顯示,在ORF14/15擴(kuò)增中,分別有6530 bp、6533 bp和5138 bp的片段缺失,而在ORF23/24擴(kuò)增中有12070 bp大片段的缺失,不同地區(qū)樣本中未能成功擴(kuò)增ORF75,而ORF94的重復(fù)單元數(shù)目分別為0、3、4、12不等,ORF125的重復(fù)單元數(shù)目為0、7。SNP分析表明,含有3個(gè)RUs的ORF94在48位的堿基為T、T、T,RUs為4的在48位的堿基為T、T、T、T,RUs為12的在48位的堿基分別為T及11個(gè)A。而ORF125所有RUs為7的情況在8、18、25、66、69位置的堿基均為G、G、G、G、A,在9、50、53、61位的堿基也普遍出現(xiàn)了變異。結(jié)果表明,WSSV在中國不同地區(qū)存在一定程度的變異,其在序列中的缺失以及重復(fù)單元數(shù)目和SNP的差異較為明顯。第二章:為了了解2014年中國大部分地區(qū)WSSV ORF14/15、ORF23/24、ORF75、ORF94和ORF125的變異情況,本文選擇2014年1月至8月期間采集的48份WSSV陽性樣本,用特異引物擴(kuò)增片段,連接于T載體轉(zhuǎn)化至Top10中,篩選陽性克隆,測(cè)序分析不同樣本之間的缺失差異。結(jié)果顯示,在ORF14/15擴(kuò)增中,共有四種缺失情況,即缺失6540 bp、6530 bp、5908 bp和5138 bp。而在ORF23/24擴(kuò)增中有兩種缺失情況,即缺失12070 bp和12064 bp。ORF75的總重復(fù)單元數(shù)目有4、10、11、12、13不等,ORF94的重復(fù)單元數(shù)目有4和14不等,而ORF125的重復(fù)單元數(shù)目有0、3、5、6、7不等。WSSV在中國大部分地區(qū)存在一定程度的變異,而不同毒株之間在ORF14/15可變區(qū)差異比較明顯,在ORF23/24可變區(qū)差異不大,但均具有大片段缺失,且毒株間在0RF75、ORF94和ORF125中重復(fù)單元數(shù)目存在比較明顯的差異。第三章:本實(shí)驗(yàn)針對(duì)2015年4月至10月期間在山東、江蘇、天津、浙江、海南、廣東五省市,采集到的57份檢測(cè)WSSV顯示陽性的樣本,通過特異性的擴(kuò)增目的片段,比較不同地區(qū)、不同分離株之間在ORF14/15、ORF23/24上的缺失變異情況,以及ORF75、ORF94和ORF125上的重復(fù)單元數(shù)目差異。結(jié)果顯示,在ORF14/15擴(kuò)增中,分別有6530 bp、5908 bp和5725 bp的片段缺失,而在ORF23/24擴(kuò)增中均有12070 bp大片段的缺失,ORF75的45 bp的重復(fù)單元數(shù)目分別為1、2、3,102bp的重復(fù)單元數(shù)目均為1,而ORF94的重復(fù)單元數(shù)目分別為4、5、10、12不等,ORF125的重復(fù)單元數(shù)目為3、5、6。第四章:WSSV基因組之間的差異也引起了不同分離株之間毒力的差異。MiRNA在防御病毒的調(diào)節(jié)中起著重要的作用。為了探究凡納濱對(duì)蝦在經(jīng)過不同毒力的WSSV感染后,mi RNA的差異表達(dá),將高毒力和低毒W(wǎng)SSV感染后對(duì)蝦的肝胰腺作為實(shí)驗(yàn)樣本,通過高通量測(cè)序,建立了H文庫和L文庫。H文庫中有29,398,623個(gè)raw reads,而在L文庫中有29,398,623 raw reads。一共有37個(gè)差異表達(dá)的功能性mi RNA,相對(duì)于低毒力的表達(dá)情況,其中上調(diào)的mi RNA有16個(gè),而下調(diào)的mi RNA有21個(gè)。Igi-mi R-1175-3p是差異最為顯著的mi RNA,其次分別是bmo-mi R-1175-3p和ipu-mi R-26b。根據(jù)差異mi RNA預(yù)測(cè)的靶基因在生物過程、信號(hào)調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化和凋亡、免疫識(shí)別和其他過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于針對(duì)不同毒力感染后的mi RNA差異反應(yīng)的后續(xù)研究起到一定作用。
【圖文】：

WSSV 樣本擴(kuò)增中, 有 5 份樣本(20#、22#、60#、62帶, 能夠成功擴(kuò)增樣品的比率為 7.81%, 其中 62#條圖 1-1), 除了河北省滄州、黃驊和唐海, 其他地區(qū)樣在 ORF23/24 擴(kuò)增中, 僅有 1 份(62#)河北唐海的樣本本未有檢出, 檢出率為 1.56%(圖 1-2)。針對(duì)于 VN出現(xiàn)相應(yīng)條帶(圖1-3)。而在ORF94擴(kuò)增中, 共有9#、26#、32#、33#、62#、63#), 而海南三亞、廣東山東日照、天津漢沽以及部分河北唐海和黃驊的樣 14.06%, 其中 26#、62#、63#樣本的目的條帶較之其#的樣本有兩條擴(kuò)增條帶出現(xiàn), 這可能是由于樣本中整造成。在 ORF125 擴(kuò)增中, 有 25 份樣本(17#、12#、33#、36#、39#、42#、46#、47#、48#、49#、5#、58#、60#、62#、63#)出現(xiàn)相應(yīng)擴(kuò)增條帶, 檢出率東日照以及濰坊地區(qū)的樣本未有檢出(圖 1-5)。

1-2 引物 ORF23/24 的擴(kuò)增結(jié)果DNA Maker DL 2000; (+)陽性對(duì)照, ( )陰性對(duì)照; 1~64: Amplification result of preimer ORF23/24 Maker DL 2000; (+) positive control, ( ) negative control; 1 641-3 引物 ORF75 的擴(kuò)增結(jié)果DNA Maker DL 2000; (+)陽性對(duì)照, ( )陰性對(duì)照; 1~64:
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S945.4

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本文編號(hào)：2694848