【摘要】：青魚(Mylopharyngodon piceus)是我國的“四大家魚”之一,是中國淡水養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟種類。青魚在自然條件下受大量病原微生物的影響,嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)是引起青魚患細菌性敗血癥的主要病原體,青魚患病后死亡率極高,這對青魚養(yǎng)殖造成了嚴重的經(jīng)濟損失。本研究通過GFP熒光蛋白標記嗜水氣單胞菌,觀察嗜水氣單胞菌在青魚體內(nèi)的感染路徑。通過轉(zhuǎn)錄組探究了抗病和易感青魚免疫應(yīng)答的差異。基于轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)對青魚MpMyD88基因進行了鑒定和功能分析。在本研究中獲得的結(jié)果如下:將重組質(zhì)粒(p-GFPuv-K)轉(zhuǎn)化到嗜水氣單胞菌中并成功表達,其與野生菌株的半致死濃度(LC50)和生長曲線類似。檢測了青魚感染標記菌株后72小時內(nèi)青魚的鰓、肝、脾、腸、體腎、頭腎、肌肉、眼、腦、心臟組織和血液中嗜水氣單胞菌的數(shù)量。數(shù)據(jù)表明青魚的鰓、腸和受傷的皮膚,是嗜水氣單胞菌進入體內(nèi)主要的途徑,血液是嗜水氣單胞菌在體內(nèi)傳播的介質(zhì)之一,養(yǎng)殖密度的增加會增加病菌的感染時間。在轉(zhuǎn)錄組研究中,共有5243個基因在GO(Gene ontology)分析中被富集,并且在KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome)分析中發(fā)現(xiàn)了323個相關(guān)通路。共發(fā)現(xiàn)了1935個差異表達的基因,主要參與細胞粘附,病原體識別,細胞免疫,細胞因子,補體系統(tǒng)和鐵轉(zhuǎn)運。在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出MpMyD88基因,其cDNA全長為1658bp,開放閱讀框長度為855bp,編碼284個氨基酸的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)具有保守的死亡結(jié)構(gòu)域和典型的TIR結(jié)構(gòu)域。發(fā)現(xiàn)MpMyD88廣泛分布在測試的組織中。MpMyD88過表達或敲降后,細胞因子(TNF-α,IFN-α,IL-6,IL-8)也相應(yīng)的出現(xiàn)顯著的上調(diào)或下降。過表達MpMyD88的細胞抗菌能力顯著強于對照組,而敲降組則顯著低于對照組,并發(fā)現(xiàn)MpMyD88基因的過表達顯著提高了NF-κB的活性。
【圖文】：

組質(zhì)粒以及標記菌株篩選（A）質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖譜（B）含有 p-GFPuv-K 質(zhì)粒的 DH5下具有熒光（C）AH4332GFPuv在 UV 燈下具有熒光（D）AH4332GFPuv傳代培養(yǎng)第十天菌株熒光。 1 Recombinant plasmid and screening of fluorescently labeled strains. (A) Map of plasmre. (B) DH5α containing p-GFPuv-K plasmid is fluorescent under UV light. (C)AH4332Gorescence under UV light. (D) The fluorescence ofAH4332GFPuvon the tenth day of subcu-GFPuv-K 質(zhì)粒穩(wěn)定性以及 AH4332GFPuv菌株的特征鑒定過 2.4 中所述的方法，標記菌株在 LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第 10 天后，將的菌液稀釋 1000 倍后，在含有 Kana 的 LB 固體培養(yǎng)基中，，發(fā)現(xiàn)所有的 燈照射下都有熒光（圖 1D），即，p-GFPuv-K 在 AH4332GFPuv 中能夠

為了更好的比較 AH4332GFPuv 和野生菌株的在生長速率上的差異，通過 2中所述的方法繪制了 AH4332GFPuv 和野生菌株的生長曲線（圖 2A），從圖中發(fā)兩株菌的生長曲線十分相近，其對數(shù)生長期，以及最高峰值時間基本一致。在半致死濃度的比較中，發(fā)現(xiàn)在不同的病菌濃度下，被兩株菌感染的青魚的活率基本一致，如圖 2B，從圖中看到兩株菌的半致死濃度都在 4.8 107，而且在他濃度下的存活率也十分接近。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S943

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本文編號：2694502