【摘要】：日本沼蝦(Macrobrachium nipponinse)是我國(guó)淡水養(yǎng)殖中重要的經(jīng)濟(jì)蝦類之一。隨著集約化的養(yǎng)殖,環(huán)境脅迫成為日本沼蝦養(yǎng)殖過程中的關(guān)鍵問題,而氨氮是水產(chǎn)養(yǎng)殖中最重要的環(huán)境脅迫因子之一,能夠嚴(yán)重影響水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育與生理健康。因此研究日本沼蝦抗氨氮脅迫的分子機(jī)制尤為重要。銜接蛋白Syntenin(MnSyn)是普遍存在于真核生物及原核生物中的胞內(nèi)銜接蛋白(adaptor proteins),在細(xì)胞免疫和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。ADP核糖基化因子2(MnArf2)是Ras基因超家族中的成員,能夠調(diào)節(jié)磷脂酶D的活性,在物質(zhì)運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)以日本沼蝦為實(shí)驗(yàn)材料,采用RACE克隆、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot和酶活測(cè)定等技術(shù),對(duì)MnSyn、MnArf2基因進(jìn)行了克隆鑒定和基因表達(dá)與功能檢測(cè),同時(shí)對(duì)高濃度氨氮脅迫下日本沼蝦抗氧化酶的相關(guān)變化進(jìn)行了測(cè)定。主要研究結(jié)果如下:首先在實(shí)驗(yàn)室條件下,通過對(duì)日本沼蝦進(jìn)行氨氮脅迫試驗(yàn)得到其半數(shù)致死濃度LD50(48h)為96.8mg/L。酶活性測(cè)定顯示,氨氮脅迫初期日本沼蝦肝胰腺、鰓和肌肉組織的總抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)均出現(xiàn)顯著的上升趨勢(shì)。在脅迫后期T-AOC和SOD出現(xiàn)明顯的下調(diào),說明機(jī)體的抗氧化酶活性受到明顯的抑制。丙二醛(MDA)的含量在脅迫初期無(wú)明顯變化,脅迫24h后MDA的水平顯著高于對(duì)照組,且出現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì),表明日本沼蝦的組織細(xì)胞受損程度逐漸嚴(yán)重。通過分子克隆和RACE技術(shù),獲得了長(zhǎng)度為2432bp的日本沼蝦MnSyn基因cDNA全序列。其中包含62bp的5′UTR、1475bp的3′UTR和957bp的CDS區(qū),其中開放閱讀框編碼為318個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì),預(yù)測(cè)該蛋白分子量為34.26KDa。該基因編碼的蛋白質(zhì)有兩個(gè)串聯(lián)存在的PDZ結(jié)構(gòu)域。同源性比較分析發(fā)現(xiàn)MnSyn與凡納濱對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦和日本囊對(duì)蝦Syntenin基因的相似性均較高,分別依次是78%、77%和75%,在進(jìn)化過程中比較保守。日本沼蝦MnArf2基因全長(zhǎng)為949bp,包含264bp的5′UTR、148bp的3′UTR以及537bp的CDS區(qū),其中537bp開放閱讀框編碼為178個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì),預(yù)測(cè)該蛋白分子量為19.98KDa。序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),MnArf2與日本對(duì)蝦Arf相似性70%,與凡納濱對(duì)蝦Arf-like相似性69%。MnArf2含有典型的Switch、Interswitch區(qū)和Ploop區(qū)。Switch、Interswitch區(qū)參與調(diào)節(jié)Arf分子在GDP/GTP間相互轉(zhuǎn)化,這些結(jié)構(gòu)均能夠反映出MnArf2在進(jìn)化上是高度保守的。熒光定量檢測(cè)結(jié)果顯示,在氨氮脅迫后的8個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0h,3h,6h,12h,24h,48h,72h,96h),日本沼蝦MnSyn基因和MnArf2基因在各組織的表達(dá)量均發(fā)生了明顯的變化。氨氮脅迫6h后MnSyn基因的表達(dá)量開始上升,在24h處表達(dá)量達(dá)到峰值,之后開始下降,72h后仍與對(duì)照組有顯著差異。MnArf2在氨氮脅迫后6h表達(dá)量顯著上調(diào),脅迫12h處達(dá)到峰值,之后開始下調(diào),72h后逐漸恢復(fù)到初始水平。Western Blot結(jié)果表明,MnSyn蛋白在日本沼蝦的肝胰腺、鰓、肌肉、心、胃和眼柄中均有表達(dá)。且在肝胰腺和鰓組織中的表達(dá)量最高,眼柄和胃組織中的表達(dá)量較低,差異顯著(P0.05)。綜合分析試驗(yàn)結(jié)果,氨氮脅迫后日本沼蝦MnSyn和MnArf2基因均出現(xiàn)顯著的上調(diào)表達(dá),在肝胰腺、鰓以及心組織中表達(dá)量較高,表明MnSyn和MnArf2基因與日本沼蝦受氨氮脅迫產(chǎn)生的免疫應(yīng)答反應(yīng)有關(guān)。本研究為進(jìn)一步揭示日本沼蝦抗氨氮脅迫的分子機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ),同時(shí)也為日本沼蝦的健康養(yǎng)殖提供了科學(xué)依據(jù)。
【圖文】：

圖 1.1 活性氧分子對(duì)細(xì)胞的損傷（Nordberg &Arnér, 2001）Fig. 1.1The damaga of ROS to cell (Nordberg &Arnér, 2001)殼動(dòng)物為了減輕活性氧分子給機(jī)體帶來的損傷，在自身的進(jìn)化過程中產(chǎn)生作用的酶。這些酶能夠迅速的通過氧化還原作用將在體內(nèi)形成的過氧化物物質(zhì)（Cerutti, 1985）。常見的抗氧化酶有超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和酶等。超氧化物歧化酶的特點(diǎn)是含有金屬結(jié)構(gòu)的一類酶，根據(jù)結(jié)合金屬離 Fe/ZnSOD、Cu/ZnSOD、FeSOD、NiSOD 和 MnSOD 五中超氧化物歧化andalios, 2002; Lin et al., 2008）。超氧化物歧化酶能夠在呼吸爆發(fā)后使超氧歧化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為的氧氣和過氧化氫。過氧化物還原酶是一種能夠還原過是甲殼動(dòng)物體內(nèi)必不可少的一種抗氧化酶。過氧化物還原酶分布在細(xì)胞核胞器和細(xì)胞質(zhì)溶膠中（Kim et al., 2005; James et al., 2010）。甲殼動(dòng)物體內(nèi)酶能夠聯(lián)合發(fā)生作用，保證了機(jī)體不受活性氧分子的傷害，從而維持機(jī)體動(dòng)。

圖 3.1 日本沼蝦肝胰腺總 RNA 電泳條帶Fig. 3.1 The total RNAagarosegel electrophoresis of Macrobrachium nipponensen 基因試驗(yàn)結(jié)果n 基因 cDNA 的克隆及序列分析沼蝦肝胰腺反轉(zhuǎn)錄的 cDNA 為模板，用自行設(shè)計(jì)的上下游引 MnSyn 基因，得到該基因的中間片段。進(jìn)一步跟據(jù)中間片段的特異性引物SY5-R1 和SY5-R2，以及3′RACE特異性引物SY3-RNAMAN 8.0 和 Chroma 等軟件處理拼接后得到基因的 cDNA 全A 序列全長(zhǎng)為 2432bp，，包含 62bp 的 5′UTR、1475bp 的 3′UTCDS 區(qū)編碼 318 個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量（Mw）為 34.26KDa，在線預(yù)測(cè)軟件分析顯示，MnSyn 包含 PDZ1 和 PDZ2兩個(gè)串聯(lián)存 3.2）
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2692373